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水稻是全世界重要的粮食作物。多种水稻病毒的侵染会给水稻生产带来了严重危害,其中水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)和水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)是两种重要的水稻病毒。感病水稻品种被RSV侵染后表现为心叶褪绿和捻转、弧圈状下垂并枯死,导致稻苗枯死。在水稻后期感染虽不枯死,但破坏水稻的生殖生长,造成抽穗不正常,严重影响水稻产量,但到目前为止,RSV诱导症状产生的机理尚不清楚。此外,种植抗病品种是防治水稻病毒病害经济有效的策略,由于缺乏常规抗性种质资源,获得遗传改良水稻种质资源成为迫切的问题。本研究利用基于i TRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)的比较蛋白质组学分析了RSV侵染水稻前后的蛋白组差异,共鉴定了681个差异表达蛋白质。生物信息学分析表明,在RSV侵染后水稻中表达下调70%以上差异蛋白质主要位于叶绿体,参与了叶绿素代谢过程。其中叶绿素合成相关的镁离子螯合酶(magnesium chelatase)的三个亚基中的CHLI(magnesium chelatase subunit I)和CHLD(magnesium chelatase subunit D)在m RNA和蛋白质水平上均显著减少,说明了RSV的侵染引起水稻叶片中的叶绿素合成受到抑制。在RSV侵染水稻后表达上调的蛋白质中,感病叶片中天冬氨酸蛋白酶(Aspartic protease,ASP)表达量明显增高,而在水稻发育过程中,天冬氨酸蛋白酶可以触发水稻细胞的程序性死亡,说明了RSV侵染诱导天冬氨酸蛋白酶的上调表达有可能是引起心叶枯死的原因。此外,RSV侵染后,Bet v 1抗原家族蛋白质、70 k Da热激蛋白质(Hot shock protein 70 k Da,HSP70)和超氧化物歧化酶触发了植物的防御反应。酵母双杂交进一步发现了蛋白质RAP与RSV的病害特异蛋白(SP)在细胞内互作,为揭示水稻条纹叶枯病症状形成的分子机制奠定了基础。在利用转基因技术获得了由RSV外壳蛋白基因形成的发卡结构(RSV-pc3-hp RNA)介导抗RSV的转基因水稻材料的基础上,s RNA(small RNA)印迹分析检测到与pc3基因序列互补的21 nt-24 nt si RNAs(small interfering RNAs),而RNAi产生的21 nt-24 nt si RNAs具有抗病活性,说明了发卡结构诱发了RNAi介导的抗病进程,从而导致特异性的si RNAs产生。与非转基因水稻相比,转基因水稻中AGO1B(Argonaute,AGO)、AGO1C、AGO1D、RDR4(RNA-dependent RNA polymerase,RDR)、SHL2(SHOOTLESS2)和DCL1A(Dicer-like,DCL)表达上调,而AGO1A、AGO18和SHO1(SHOOT ORGANIZATION1)表达下调。在RSV侵染后转基因水稻中AGO2表达上调,而AGO1B、AGO1C、AGO1D、AGO11、AGO16、RDR2、RDR4、SHL2、DCL1A、DCL1C和DCL3B表达下调。这说明了RSV侵染可改变转基因水稻中AGOs、RDRs和DCLs表达量。本研究将RSV外壳蛋白部分基因和RBSDV外壳蛋白部分基因组成基因(RSV-HCP-RBSDV-HS10),并将其基因插入到载体p MCG161上形成发卡结构(RSV-HCP-RBSDV-HS10-hp RNA),然后将发卡结构构建到改造过的载体p CAMBIA1301(去除潮霉素基因)上,获得载体p CAMBIA1301-DB。采用双菌双质粒的共转化法等转基因技术获得了转基因材料。在此基础上,田间抗病筛选转基因材料获得了抗RBSDV和RSV的转基因水稻后代,并且利用PCR检测到T2、T3和T4代转基因水稻中只含有RSV-HCP-RBSDV-HS10基因不含潮霉素基因,从而获得无标记基因的抗RSV和RBSDV的转基因水稻。Southern印迹分析明确了RSV-HCP-RBSDV-HS10基因整合到水稻基因组中,并且转基因水稻含有多个拷贝的目的基因。s RNA印迹分析检测到与RSV-HCP-RBSDV-HS10序列互补的21 nt-24 nt si RNAs,说明了RSV-HCP-RBSDV-HS10-hp RNA诱发RNAi介导抗病过程,导致特异性的si RNAs产生。