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背景加快异基因骨髓移植(allogeneic bone marrow transplantation,allo-BMT)后T细胞重建能够降低感染和肿瘤复发的几率。胸腺移植(thymus transplantation,TT)作为一种提高胸腺功能、加快T细胞重建的方法,已被临床用于治疗DiGeorge综合征、严重联合免疫缺陷病、艾滋病等疾病。前期研究显示,TT联合allo-BMT不但能够促进T细胞重建,加强抗肿瘤效应,而且不会引起严重的移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)。然而胸腺供体来源缺乏制约了 TT 在 allo-BMT 的应用。诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS cells)具有和胚胎干细胞相似的功能,学者们已成功将iPS细胞诱导分化为造血祖细胞、神经元、胰岛β细胞、肝细胞、血管内皮细胞等。iPS细胞技术为培养人工胸腺提供了新思路。目前国内外尚未有将iPS细胞诱导分化为胸腺并运用于异基因骨髓移植的研究报道。研究目的本课题组前期研究将表达绿色荧光蛋白的C57BL/6小鼠的iPS细胞,通过显微注射到ICR小鼠囊胚腔内,获得的嵌合胚胎移植到代孕雌性ICR小鼠子宫内,最终获得嵌合子代,用iPS细胞成功构建了嵌合体胸腺。本研究首次将嵌合体胸腺用于allo-BMT时的TT,探索其对受体T细胞重建和GVHD的影响。旨在解决TT的来源,并寻找一种加快allo-BMT后T细胞重建的新方法。研究方法1.异基因骨髓内骨髓移植、胸腺移植和淋巴细胞输注异基因骨髓内骨髓移植(intra-bone marrow-bone marrow transplantation,IBM-BMT):受体 BALB/c小鼠移植前24h均接受X射线全身照射。取C57BL/6小鼠的股骨和胫骨的骨髓细胞(bone marrow cells,BMCs),制成单细胞悬液。将受体小鼠麻醉,使用微量注射器穿过关节囊将BMC1×107/mouse注入胫骨骨髓腔内。TT:取嵌合体小鼠胸腺,分离为大小约2×2×1mm的组织块,暴露受体左侧肾脏于体腔外,将胸腺组织块置于肾被膜下,逐层缝合肌肉及皮肤。淋巴细胞输注(donor lymphocyte infusion,DLI):取C57BL/6小鼠的脾脏,研磨,计数,通过鼠尾静脉注入5×106/mouse脾脏单细胞悬液。2.IBM-BMT+TT组的供体胸腺和各组GVHD的观察实验分三组:IBM-BMT 组,IBM-BMT+TT 组,IBM-BMT+DLI 组。移植4周后,取移植的供体胸腺行HE染色,观察组织学形态。每周测量小鼠体重2-3次,同时观察GVHD的表现。取受体小鼠的肝脏、小肠、皮肤,10%福尔马林固定,石蜡包埋,切片,HE染色,观察其GVHD的病理变化。3.检测各组T细胞亚群在移植4周后,取受体小鼠外周血,流式细胞仪分析检查植入状态、分析不同实验组T细胞亚群比例。取脾脏,流式细胞仪分析不同组Foxp3+CD4+ T细胞的比例。研究结果1.IBM-BMT+TT 组、IBM-BMT+DLI 组、IBM-BMT 组外周血 CD8+T 细胞组比例分别为(11.10±1.49)%,(8.49±0.82)%,(5.52±0.83)%,两两组间差异有统计学意义(P<0.05)。IBM-BMT+TT组的外周血CD4+T细胞比例为(9.60±0.69)%,显著高于 IBM-BMT+DLI 组的(8.07±0.65)%及 IBM-BMT 组(6.42±1.40)%(P<0.05)。2.IBM-BMT+TT、IBM-BMT组的脾脏Foxp3+细胞占CD4+T细胞比例分别为(1.86±0.36)%、(2.29±0.23)%,显著高于 IBM-BMT+DLI组(0.07±0.05)%(P<0.05)。3.IBM-BMT+TT、IBM-BMT 组的 GVHD 临床评分低于 IBM-BMT+DLI 组,病理学检查GVHD表现更轻。结论:1.iPS细胞来源的嵌合体胸腺移植,通过胸腺依赖路径,能有效加快移植后的CD4+和CD8+ T细胞数目的恢复,支持Foxp3+CD4+ T细胞(即Treg细胞)的发育,促进T细胞重建。2.IBM-BMT+TT组GVHD反应轻,可能是嵌合体胸腺支持Foxp3+CD4+ T细胞的产生,抑制GVHD反应。3.iPS细胞来源的嵌合体胸腺移植能促进T细胞重建,并不引起严重GVHD,为解决TT的来源和allo-BMT后T细胞重建迟缓和免疫排斥的提供了新方法。