研究背景：癫痫是人类最常见的神经疾病之一,它严重影响患者的生活质量,危及人类健康。近年来,虽然针对癫痫病因、机制及治疗等的研究工作已经取得了很大进展,但是有关其形成发展过程,即癫痫发生,的确切机制仍未完全阐明。大量实验性数据表明缺氧、脑外伤和惊厥等外源性损伤因素能够触发一系列与癫痫发生密切相关的细胞、分子和神经网络联系改变的事件,进而诱发自发性反复惊厥发作或癫痫形成。当前,在癫痫发生急性期和亚急性期内的神经炎性事件受到了较为广泛的关注,资料显示多种细胞因子或炎性介质在癫痫形成过程中具有重要意义。趋化因子作为一类调控免疫细胞活化和迁移的小分子蛋白家族,近几年来,其在中枢神经系统(central nervous system, CNS)炎性病变中的作用得到了广泛的研究。巨噬细胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1alpha, MIP-1α)是β-趋化因子亚家族成员之一,可来源于多种细胞,如淋巴细胞,单核细胞／巨噬细胞,肥大细胞,上皮细胞和成纤维细胞等,能够介导细胞因子的产生和免疫炎性细胞的迁移聚集。在神经病理情况下,趋化因子MIP-1α能够被快速的诱导,特征性的表达于某些脑区或神经元损伤部位,但是其具体的细胞来源及其所产生的生物学功能尚不明确。我们己知,趋化因子生物学效应的实现需要其与细胞表面特异性的G-蛋白偶联受体结合,通过激活胞内信号发挥作用。趋化因子受体5(chemokine receptor5, CCR5)是MIP-1α在CNS内最受关注的高亲和力受体分子之一,可表达在脑实质内的多种细胞,如胶质细胞和神经元细胞。近期,在兴奋性毒性脑损伤模型中,关于CCR5的表达模式及其潜在作用的研究也得出差异性结论。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase, MAPKs)、磷脂酰肌醇激酶及核因子-κB(nuclear factor κB, NF-κB)等信号分子广泛分布在CNS,惊厥等病理性因素能够诱导上述多个信号途径的活化,调控基因的表达。大量体外实验证实MAPKs、NF-κB等信号途径能够调控脑源性细胞中多个趋化因子和受体的表达。但是关于MIP-1α/CCR5轴表达调控的体内研究鲜见报道,因此,当前有必要对MIP-1α/CCR5在癫痫形成中表达、作用及其调控机制进行深入的研究。另外,已有资料显示惊厥发生的易感性及其神经元损伤、神经炎性反应等均呈现年龄依赖性的特征,而且趋化因子和受体的诱导性表达也可能因年龄的不同而存在差异。早前关于MIP-1α和/或CCR5的实验和临床性研究更多是集中在新生儿期和成年期,然而临床上很多颞叶癫痫的成人患者可能始发于幼儿或青少年时期的痫性发作。因此,当前的研究选择幼年期大鼠作为研究对象,通过侧脑室内注射海人酸(kainic acid, KA),建立可重复的惊厥模型,并且评估远期的脑电图(electroencephalogram, EEG)变化及自发惊厥行为,进而我们观察了MIP-1α/CCR5轴在幼鼠癫痫发生早期阶段海马组织中的表达特点；通过阻断MIP-1α/CCR5轴活性,观察小胶质细胞、血脑屏障和神经元等相关指标的变化,明确MIP-1α/CCR5轴在癫痫发生中生物学功能和意义；应用MAPKs抑制剂(PD98059或SB203580)或NF-kB抑制剂(PDTC),探讨可能调控MIP-1α/CCR5轴的分子信号通路。研究分三部分。第一部分MIP-1α/CCR5生物轴在幼鼠癫痫发生中表达的实验研究目的：观察KA侧脑室内注射诱发癫痫持续状态(status epilepticus, SE)后幼鼠海马MIP-1α和CCR5的表达特点,探讨MIP-1α/CCR5轴与神经病理变化之间的潜在联系。方法：1.应用立体定向技术侧脑室内注射KA,建立幼鼠惊厥模型。将生后21天(postnatal day21, P21)的wistar大鼠分为正常组、对照组,KA4h、8h、16h、24h、3d、5d组。根据前期预实验的结果,对照组中用于mRNA检测的设为PBS注射后8h和24h组,用于蛋白检测的设为PBS注射后24h组。此外,慢性期内15只KA大鼠和7只PBS对照大鼠于2月后进行视频脑电检测和惊厥行为的评估。2.苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)、Nissl和Fluoro-Jade B(FJB)染色检测各实验组大鼠各海马亚区(CA1,CA3和Hilus)内神经元的形态及损伤情况。3.免疫组织化学方法检测各组大鼠各海马亚区内OX-42, MIP-1α和CCR5阳性细胞的表达情况。4.实时定量RT-PCR方法检测各组大鼠海马内MIP-1α和CCR5mRNA的表达。5.应用ELISA和VVestern blot方法分别检测各组大鼠海马内MIP-1α和CCR5蛋白水平的表达。6.免疫荧光双重标记检测技术观察多组大鼠海马内MIP-1α和CCR5的细胞分布。结果：1.建立大鼠KA癫痫模型。在KA注射后15-30min,所有的大鼠出现深大呼吸,点头及前肢阵挛；注射后30-40min,大鼠出现旋转,站立跌倒,渐至强直阵挛发作,持续约2-4h。另外,在评估慢性期惊厥行为的研究中,结果显示67%(8/12)的KA大鼠出现自发性反复惊厥发作；在PBS对照组,没有出现惊厥发作2.KA注射后海马内神经元损伤和小胶质细胞的反应。HE、Nissl和FJB染色显示：与正常组相比,在KA注射后8h,大鼠海马CA3和Hilus区出现少量受损神经元；在KA后24h,CA3区神经元细胞缺失明显,然而,CA1区内神经元细胞缺失出现相对较迟,显著的变化发生在KA后72h。OX-42免疫组化显示：在正常组,阳性细胞稀疏的散布于整个海马；KA后24h,阿米巴样小胶质细胞在海马锥体细胞层和门区明显聚集；KA后72h,小胶质细胞在损伤区内的聚集更加显著。3.海马内MIP-1α表达。实时定量RT-PCR检测显示：与正常组相比,海马MIP-1α mRNA在KA后4h明显增高(P<0.01),8-16h达顶峰(P<0.01),持续至3d(P<0.05)。ELISA分析显示：与正常组相比,MIP-1α蛋白水平在KA后8-16h呈现明显升高(P<0.01),24h达顶峰(P<0.01),在5d时仍略增高(P<0.05)。免疫组化检测显示：在正常组大鼠,难以检测到MIP-1α的表达；在KA后16h, MIP-1α免疫活性明显增高,尤其在海马CA3区；在KA后24h,CA3和Hilus区MIP-1α的表达进一步增高；在KA后3d,CA3和Hilus区MIP-1α的表达较KA后24h显著下降,但是CA1区内仍可见高表达的MIP-1α。免疫荧光双重标记检测显示：KA诱导的MIP-1α免疫活性来源于OX-42标记的小胶质细胞而不是GFAP标记的星型胶质细胞。4.海马内CCR5表达。实时定量RT-PCR检测显示：与正常组相比,海马CCR5mRNA在KA后8h明显增高(P<0.05),24h达高峰(P<0.01)。Western blot分析显示：与正常组相比,CCR5蛋白水平在KA后16h明显升高(P<0.01),于24h达顶峰(P<0.01),之后呈现下降趋势。免疫组化检测显示：在正常组大鼠,CCR5免疫阳性细胞分布于整个海马,具有圆或椭圆形态,血管内皮内亦可见阳性颗粒；在KA后24h,显著增强的染色颗粒主要分布在CA3及Hilus o在KA后3d, CA1区内可见高表达的CCR5染色颗粒。免疫荧光双重标记检测显示：在正常组大鼠,CCR5阳性颗粒在OX-42和GFAP标记的细胞均有表达；KA注射后,诱导的CCR5阳性细胞主要来源于OX-42标记的小胶质细胞。结论：1.幼鼠侧脑室内KA注射诱导的SE能够成功引起慢性期自发性发复惊厥发作,提示其是诱发癫痫发生的始动因素之一。2.在KA侧脑室注射诱发SE后的早期阶段,海马MIP-1α/CCR5由的表达明显增加,而且MIP-1α和CCR5表达分布与特征性神经元损伤和小胶质细胞聚集的区域呈现高度的一致。第二部分MIP-1α/CCR5生物轴在幼鼠癫痫发生中的生物学功能和意义目的：分别应用抗MIP-1α抗体(anti-MIP-1α antibody)或CCR5拮抗剂(D-ala-peptide T-amide, DAPTA)阻断MIP-1α/CCR5轴的生物学活性,探讨其在小胶质细胞反应、血脑屏障通透性及神经元细胞损伤等与癫痫发生密切相关的病理学变化中的作用。方法：1.检测MIP-1α生物学功能时,P21天的wistar大鼠分为PBS+IgG组,KA+IgG组及KA+anti-MIP-1α组。IgG(或anti-MIP-1α)侧脑室注射于PBS(或KA)注射同时和PBS(或KA)注射后16h进行两次。各组大鼠分别于KA(或PBS)侧脑室注射后24h和3d处死,取材备用。2.检测CCR5生物学功能时,P21天的wistar大鼠分为KA+saline组及KA+DAPTA组。DAPTA的干预性治疗于KA注射同时,KA注射后24、48h共进行三次,saline作为干预性治疗的对照,亦依次进行。各组大鼠于KA侧脑室注射后3d处死,取材备用。3.检测MIP-1/CCR5轴对自发性反复惊厥发作影响时,P21的wistar大鼠分KA+saline组和KA+DAPTA组。DAPTA干预性治疗于KA注射同时、注射后1、2、3、4和5d共进行6次皮下注射,saline作为干预性治疗的对照,亦依次进行。KA注射后2m,两组大鼠首先进行脑电和行为学检测,后处死取材。每组10只。4.免疫组织化学方法检测各组大鼠海马OX-42、内皮屏障抗原(endothelial barrier antigen, EBA)和ZO-1阳性细胞的表达。5. Western blot方法分别检测各组大鼠海马ZO-1和occludin的表达。6.FJB染色检测各组大鼠海马CA1和CA3区神经元的形态及损伤情况。7.免疫荧光双重标记染色检测大鼠海马内增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)与ED-1标记活化小胶质细胞的共分布情况。结果：1. MIP-1α中和抗体对小胶质细胞的影响。免疫组化分析显示：与KA+IgG组相比,KA+anti-MIP-1α组小胶质细胞数量明显减低(P<0.05)；但小胶质细胞的形态和增殖率在两组之间的没有发现明显变化。2. MIP-1α中和抗体对血脑屏障的影响。伊文思蓝(Evans blue, EB)勺定性及定量分析显示：与KA+IgG组相比,KA+anti-MIP-1α组EB荧光强度和含量均明显减低(P<0.05)。EBA免疫组化显示：在PBS+IgG组,阳性颗粒分布于血管壁,呈现连续的管样结构；然而,在IgG+KA组,EBA连续性受到严重破坏,染色弱；在KA+anti-MIP-1α组,EBA染色呈现一定的连续性,染色明显。Western blot分析显示：与KA+IgG组相比,KA+anti-MIP-1α组ZO-1和occludin表达均明显增强(均P<0.05)。3. MIP-1α中和抗体对神经元的影响。与KA+IgG组相比,KA+anti-MIP-1α组神经元损伤受到明显抑制(P<0.05)。4. DAPTA对海马小胶质细胞、血脑屏障及神经元功能的影响。与KA+saline组相比,KA+DAPTA组大鼠海马小胶质细胞的数量、EB含量和FJB阳性细胞数量均明显减低(均P<0.05)。5. DAPTA对慢性期自发性反复惊厥发作的影响。与KA+saline组相比,KA+DAPTA组大鼠平均惊厥发生频率(2.4±0.9次/d,1.5±0.5次/d)和发作间歇的异常放电频率(5.4±0.7/min,2.8±0.7/min)均明显减低(均P<0.05)。结论：1.在KA侧脑室注射诱发SE后,上调的MIP-1α/CCR5轴能够诱导神经元损伤区小胶质细胞的迁移、聚集,但不影响小胶质细胞的活性和增殖。2.在KA侧脑室注射诱发SE后,上调的MIP-1α/CCR5轴可能通过抑制海马内皮细胞紧密连结蛋白ZO-1和occludin的表达,影响血脑屏障完整性。3.在KA侧脑室注射诱发SE后,上调的MIP-lα/CCR5轴可能通过影响小胶质细胞的聚集,进而促进海马神经元损伤。4.在幼鼠癫痫发生的早期阶段,诱导表达的MIP-1α/CCR5由可能通过调控脑内小胶质细胞聚集、血脑屏障破坏及神经元损伤,促进慢性期自发性惊厥发作的发生,因此MIP-1α/CCR5轴可以考虑作为控制癫痫形成的干预性靶点。第三部分幼鼠癫痫发生中MIP-1α/CCR5表达的调控机制目的：探讨KA侧脑室注射后幼鼠海马MAPKs、NF-κB和cAMP反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)的变化规律,观察PD98059(ERK1/2抑制剂)、SB203580(p38MAPK抑制剂)或PDTC (NF-κB的抑制剂)对海马MIP-1α和CCR5表达的影响,明确调控MIP-1α/CCR5生物轴表达的分子信号机制。方法：1.检测KA注射对幼鼠海马内MAPKs和NF-κB活性影响时,将P21天的wistar大鼠分为正常组、对照组,KA4h、8h、16h、24h、3d组。根据前期预实验的结果,对照组设为PBS注射后24h组。2.检测MAPKs对MIP-1α/CCR5表达的影响时,将P21天的wistar大鼠分为PBS+DMSO组,KA+DMSO组,KA+PD98059及KA+SB203580组；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、PD98059或SB203580于KA或PBS注射前30min行侧脑室内注射。检测NF-κB对MIP-1α/CCR5表达的影响时,将P21天的wistar大鼠分为PBS+saline组,KA+saline组和KA+PDTC组；Saline或PDTC于KA或PBS注射后即刻和12h行腹腔内注射。所有大鼠均在KA或PBS注射后24h处死,取材备用。3.免疫组织化学方法检测各组大鼠海马内细胞外调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)1/2、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)和CREB等磷酸化蛋白的表达。4. Western blot方法分别检测各组大鼠海马内MAPKs、NF-κB及KB抑制因子α (inhibitor of KBa, IκBα)等的磷酸化和非磷酸化蛋白水平及CCR5的表达。5.应用ELISA方法分别检测各组大鼠海马内MIP-1α的表达。结果：1. Western blot吉果显示：与正常组相比,P-ERK1/2在KA后4h明显增高(P<0.05),8h达高峰(P<0.05),之后呈现下降趋势。海马P-p38MAPK在KA后8h显著增高(P<0.05),24-72h进一步增高(P<0.05)。在当前观察时程内,我们未能发现海马P-JNK蛋白水平的变化。免疫组化结果显示：P-ERK1/2和P-p38MAPK免疫活性的变化趋势符合相应的western blot结果,且其分布在很大程度上与MIP-1α/CCR5的表达分布相一致。关于NF-κB活性的评估,结果显示P-IκBα蛋白水平在KA注射后4h增高(P<0.05),16-24h达到高峰(P<0.05),此后降至正常水平；P-NF-KB/p65在KA注射后8h时明显增高(P<0.05),至24h仍维持在高水平(P<0.05)。P-NF-κB/p65免疫活性的变化趋势与Western blot结果相一致。2.应用MAPKs或NF-κB抑制剂后,与KA+DMSO组相比,KA+PD98059和KA+SB203580组MIP-1α/CCR5表达及小胶质细胞数量均明显减低(均P<0.05)。KA+PDTC组MIP-1α/CCR5表达亦较KA+saline组明显减低(均P<0.05)。另外,与KA+DMSO组相比,KA+PD98059和KA+SB203580组海马P-NF-KB/p65和P-CREB表达均明显减低(均P<0.05)。结论：1.在KA侧脑室注射诱发SE模型,侧脑室注射PD98059、SB203580和PDTC能够分别抑制ERK1/2通路、p38MAPK通路和NF-κB信号通路。2.在KA侧脑室注射诱发SE模型,通过应用PD98059.SB203580和PDTC,证实MAPKs (ERK1/2、p38MAPK)和NF-κB信号通路至少部分的调控癫痫发生早期阶段海马MIP-1α/CCR5的表达。3.转录因子NF-κB和CREB可作为MAPKs (ERK1/2、p38MAPK)的下游信号分子而在癫痫发生中发挥作用。