背景24小时生物节律控制生物进程的多样性。系统生物钟位于大脑的视交叉神经核,在很多的外周器官和组织中都表现出生物节律变化,例如:肝脏、肺、肾脏、心脏和皮肤。在分子水平上,生物节律的中心调控由4个重要的核心生物钟蛋白组成,包括brain and muscle ARNT-like(BMAL1),circadian locomotor output cycles kaput(CLOCK),period(PERs)和cryptochrome(CRYs)。这4种转录因子的表达通过转录翻译反馈回路调节。其中BMAL1和CLOCK形成异质二聚体并通过结合在其下游基因启动子区域的E-box(CACGTG)序列来正向调节基因表达,从而作为生物钟蛋白中正向分枝来起作用。CRYs和PERs则相反,它们属于BMAL-CLOCK的下游基因。当其表达积累到一定水平后,二者形成异质二聚体,并由胞浆移动至细胞核内,从而抑制BMAL-CLOCK的表达,产生所谓的负反馈调节回路。除此之外,BMAL1的表达还受另外两个孤核受体RORs和REV-ERBs的调节。RORs能够促进BMAL1的表达,被认为是生物节律的正向调节因子,而REV-ERBs则相反。两个孤核受体能够竞争性地与BMAL1启动子上的RORE结合来调节BMAL1的表达,从而参与生物节律调控的过程。人类的皮肤作为隔离人体与外界环境的第一道屏障,保护我们的机体抵抗各种外环境的伤害,比如紫外照射、极端温度、水分流失等等。皮肤处于长期暴露在紫外照射的环境下。根据紫外的波长不同,可以将其分为UVA(320-400 nm),UVB(290-320 nm)和UVC(200-290 nm)。一部分的UVB能够穿透大气层到达地球表面。UVB能够引起活性氧的积累从而引起DNA损伤,凋亡以及免疫反应,它是导致光老化和光致癌的主要原因。皮肤系统包括表皮,真皮和皮下组织,而表皮中90%以上的细胞是角质形成细胞。UVB所携带的能量足以穿透表皮和真皮层,从而引起角质细胞中的DNA损伤。UVB引起的DNA损伤会产生两种独特的DNA加合物:环丁烷嘧啶二聚体(CPDs)和嘧啶(6-4)光产物。在哺乳动物中,CPDs能够被核酸修复机制清除。UV引起的DNA损伤能够激活ATR-CHK1等蛋白激酶介导的信号通路,并引起其下游基因cdc25和p53的磷酸化。p53是一个十分重要的转录因子并参与UVB引起的细胞周期阻滞,凋亡和DNA损伤修复。这一信号通路的激活对于防止皮肤角质细胞癌变起到至关重要的作用。据报道,UVB引起的DNA损伤修复反应也呈现依赖时钟的节律变化。暴露在UV照射下的小鼠在DNA损伤修复薄弱的时间段更容易产生鳞状细胞癌。报道称,野生型小鼠中UVB引起的凋亡和免疫反应早晨明显强于下午,而当生物节律的核心控制基因CRY,PER或者BMAL1被敲除时,这种随一天中时间而变化的DNA损伤反应会随之消失。这些发现说明生物节律控制基因在调节DNA损伤反应和免疫反应中起到重要作用。除了参与对UVB引起的DNA损伤的修复反应,昼夜节律钟还参加调控多方面的皮肤稳态,比如:毛发生长,细胞增殖,干细胞功能,癌症发生,衰老,免疫等等。Bmal1对小鼠皮肤细胞的增殖过程起到十分重要的调节作用,其基因沉默可以导致细胞增殖加快。在人的表皮角质细胞中,核心生物钟蛋白也参与了对表皮干细胞的增殖和分化的调节。目前,生物钟基因对UV引起的DNA损伤反应的影响的报道还局限在小鼠皮肤中。而它们在人的皮肤中,特别是角质细胞中的相关作用还有待于进一步验证。目前有文献报道,4种核心生物钟基因和RORα在人的原代角质细胞和永生化角质细胞中的表达水平都能够被检测到,而且低剂量的UVB能够在人的原代角质细胞中引起核心生物钟基因的震荡表达。但是这些生物钟基因在UVB照射条件下对人的表皮角质细胞DNA损伤的影响及其分子机制也尚不明确。目的本研究我们重点探究核心生物钟蛋白BMAL1和CLOCK以及RORα在人的原代角质形成细胞和永生化HaCat角质细胞系中对UVB引起的DNA损伤反应的影响以及相关分子机制。主要集中在这些蛋白对DNA修复,细胞存活和凋亡,以及免疫反应的调控作用。1.功能研究1.1 BMAL1和CLOCK在UVB照射下对人的原代角质形成细胞和永生化HaCat角质细胞功能的研究1.1.1材料和方法:1)体外培养人的原代角质形成细胞(primary human normal keratinocytes,HKCs)和永生化角质细胞(immortal human keratitnocytes,HaCat)。2)通过小RNA干扰技术,瞬时在mRNA和蛋白水平上沉默BMAL1和CLOCK的基因表达,从而探究在UVB照射条件下,BMAL1和CLOCK对人角质形成细胞功能的影响。3)通过实时荧光定量PCR和western blot检测低剂量UVB对核心生物钟基因,细胞因子和趋化因子表达的影响。4)细胞经过剂量为5 mJ/cm~2的UVB诱导,细胞增殖通过结晶紫染色或者AlamarBlue细胞活性检测的方法完成。5)细胞凋亡检测实验则由western blot和流式细胞分析的方法完成,分别收集UVB处理过得BMAL1或CLOCK基因沉默的细胞蛋白和活细胞,蛋白检测细胞凋亡标记蛋白cleaved PARP。流式细胞分析采用Annexin V-FITC和PI双染,FITC单阳代表早期凋亡细胞,FITC/PI双阳代表晚期凋亡细胞,PI单阳则代表机械损伤的细胞,通过流式细胞检测能够清楚的将凋亡细胞检测出来。1.1.2结果:1)在人的永生化HaCat角质形成细胞和原代角质形成细胞中,5mJ/cm~2的UVB可以改变生物节律中心调控转录因子BMAL1和CLOCK的表达。2)在HaCat细胞中,5 mJ/cm~2的UVB可以诱导细胞因子TNFα,IL6,IL8,CSF2和趋化因子CXCL1的基因表达。3)在没有UV照射的正常培养条件小,小RNA介导的BMAL1和CLOCK基因沉默能够促进HaCat细胞增殖,并引起原代角质细胞分化。4)BMAL1或者CLOCK基因沉默能够阻碍UVB引起的原代角质细胞和HaCat细胞的凋亡。5)在HaCat细胞中,沉默BMAL1和CLOCK能有效抑制UVB引起的细胞因子的高表达。1.1.3结论:综上所述,我们揭示了在低剂量UVB照射条件下,生物节律中心调控因子BMAL1和CLOCK能够抑制角质细胞增殖,促进角质细胞的凋亡和免疫反应。在没有UVB照射时,BMAL1或者CLOCK基因沉默能够促进原代角质细胞的分化,从而说明这些蛋白的存在有助于对皮肤干细胞的功能的维持。1.2 RORα在UVB照射下对人的永生化HaCat角质细胞功能的研究1.2.1材料和方法:1)利用shRNA技术构建RORA基因沉默的人的HaCat稳定细胞系,体外培养,通过实时荧光定量PCR和western blot检测RORαmRNA和蛋白的表达。2)利用慢病毒包装技术,构建RORα4基因高表达的人永生化角质形成细胞稳定细胞系。3)利用流式细胞分析技术,caspase 3/7细胞活性分析方法,western blot检测细胞凋亡标志蛋白PARP表达,来分析RORα在UVB照射条件下对人的永生化角质形成细胞存活的影响。4)利用实时荧光定量PCR技术检测细胞因子/趋化因子mRNA表达,来评价RORα在UVB照射条件下对人的永生化角质形成细胞免疫反应的影响。1.2.2结果:1)在人的永生化角质形成细胞中,5 mJ/cm~2的UVB可以诱导RORα的表达。2)沉默RORα的表达能促进UVB照射条件下HaCat细胞的存活。3)沉默或者高表达RORα的表达能有效影响UVB照射条件下永生化角质形成细胞的免疫反应。沉默RORα能抑制免疫反应,高表达RORα则反之。1.2.3结论:综上所述,我们得出结论,低剂量UVB照射条件能够诱导人的永生化HaCat角质形成细胞中RORα基因呈现周期性变化表达;RORα能够促进UVB诱导的角质细胞的凋亡以及促炎症因子的表达。2.分子机制研究2.1 BMAL1和CLOCK在UVB照射下调节人的原代角质形成细胞和永生化角质细胞DNA损伤机制研究2.1.1材料和方法:1)体外培养HKCs和HaCat.2)通过小RNA干扰技术,瞬时在mRNA和蛋白水平上沉默BMAL1,CLOCK基因表达,从而探究人的角质形成细胞在UVB照射条件下,BMAL1和CLOCK对DNA损伤机制的影响。3)利用免疫荧光的方法检测UVB引起的双链DNA损伤产物环嘧啶二聚体和DNA损伤标志蛋白γ-H2AX的表达。4)利用实时荧光定量PCR和western blot的方法检测ATR-CHK1-p53信号通路中相关mRNA和蛋白的表达,从而确定BMAL1和CLOCK在人的角质形成细胞中对DNA损伤的作用机制。2.1.2结果:1)在HaCat细胞和原代角质细胞中,5 mJ/cm~2的UVB能够明显的诱导DNA损伤标志光产物CPD和γ-H2AX蛋白的表达。2)UVB引起的γ-H2AX高表达呈现时间依赖,BMAL1或者CLOCK对晚期γ-H2AX的表达水平有明显抑制作用。3)在HaCat中BMAL1或者CLOCK基因敲除对CPD的表达无明显影响。4)HaCat细胞中敲除BMAL1和CLOCK基因对UVB引起的ATR-CHK1-p53信号通路激活无明显影响,而HKCs中CLOCK基因敲除明显抑制UVB诱导的p53蛋白高表达和p53磷酸化。2.1.3结论:根据以上结果,在两种人的角质形成细胞中,BMAL1和CLOCK这两个生物节律调节蛋白对低剂量UVB导致的DNA损伤反应都起到促进作用。但其基因敲除在HaCat细胞中对ATR-CHK1-p53信号通路的激活并未产生显著效应。这可能与HaCat细胞所表达的p53基因存在突变有关。在原代角质形成细胞中,CLOCK基因沉默对UVB导致的p53蛋白总量和磷酸化的升高展示出强烈的抑制作用。这些结果说明生物节律调节蛋白在两种不同的人原代角质细胞中可能通过不同分子机制来在调控UVB导致的DNA损伤反应。2.2在人的角质细胞中,RORα在UVB照射时调节BMAL1的表达2.2.1材料和方法:1)体外培养HaCat RORαshRNA基因沉默和RORα4基因高表达的稳定细胞系。2)低剂量UVB照射HaCat RORαsh细胞,在指定的时间收集RNA和蛋白,利用实时荧光定量PCR和western blot的方法检测RORα和BMAL1 mRNA/蛋白表达。3)UVB照射HaCat RORα4高表达细胞,24小时后收集RNA,利用实时荧光定量PCR检测RORα和BMAL1 mRNA表达。2.2.2结果:1)在HaCat角质细胞中,UVB能够诱导RORα和BMAL1基因表达,RORαshRNA能够明显抑制RORα基因表达,在UVB诱导的晚期RORαshRNA能够抑制BMAL1基因的表达。2)RORα4高表达能够明显诱导RORα基因表达,在UVB诱导的晚期RORα4高表达能够诱导BMAL1基因的表达。2.2.3结论:这部分我们揭示了在HaCat角质细胞中,UVB诱导的BMAL1的表达可能部分通过RORα的调节,RORα通过调节BMAL1的表达参与生物节律的调控。结论综上所述,在人的永生化和原代角质形成细胞中,生物节律控制蛋白BMAL1和CLOCK参与调控UVB引起的DNA损伤反应,从而调控UVB引起的细胞凋亡和免疫反应。在原代角质细胞中BMAL1和CLOCK还具备抑制角质细胞分化的作用。在人的永生化HaCat角质细胞中,UVB照射条件下孤核受体RORα具有和BMAL1/CLOCK类似的作用,RORα能够调节BMAL1的表达。所以RORα有可能通过对BMAL1的表达的调节作用来控制UVB引起的角质细胞凋亡和免疫反应。展望和限度因此,我们的结果能够帮助我们更好的了解生物节律控制基因对人的角质细胞DNA损伤的调节作用。UVB被认为是一个皮肤疾病的致病因,合适剂量的UVB也被应用于多种癌症的治疗中,因而阐明生物节律基因对UVB引起的DNA损伤以及炎症反应的调控与分子机制将有助于对UVB引起对皮肤衰老和癌变机制的进一步了解,从而提出更好的抗衰老以及预防皮肤癌变发生的策略。RORα作为孤儿受体家族的成员之一,它的活性可以受内源和外源性配体调控,将RORα和BMAL1在UVB情况下联系到一起,可以通过RORα的配体改变BMAL1的活性,从而解决皮肤相关疾病治疗的时间依赖问题,RORα的配体可以为治疗皮肤DNA损伤相关疾病提供新的治疗方案。我们的实验只停留在细胞水平,仍需在动物上做进一步的验证。