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亮氨酸脱氢酶(Leucine Dehydrogenase;EC 1.4.1.9;简称LeuDH)是一种氧化还原酶,可逆地催化L-亮氨酸及支链氨基酸进行脱氨基反应,得到相应酮酸及类似物。L euDH多来源于芽孢杆菌属,为4-8个亚基的同源多聚体,现其生产方法是用单亚基基因构建表达LeuDH的大肠杆菌基因工程菌,基于酶在医疗等行业的应用,对酶的安全性要求高,亟待选择安全性更高的表达宿主。(1)本文以蛋白酶缺陷型菌株Bacillus subtilis 168为宿主异源表达Bacillus cereus ATCC14579源的LeuDH。采用Sec、Tat途径信号肽筛选策略促进LeuDH的分泌。根据信号肽N端电荷数不同,选择了7种信号肽(Sec途径的AmyQ、SacB、LipB、Npr E和Tat途径的PhoD、YwbN、LipA),考察其对LeuDH分泌的影响。选用Tat途径中含6个N端电荷数的PhoD信号肽,使LeuDH得分泌效果最好,胞外活性为20.25 U×mL-1,分泌效率为38.06%,是未加信号肽时的1.1倍。Sec途径中AmyQ、SacB效果次之,分泌效率分别为35.01%和32.64%。(2)在启动子PHpaⅡ后分别添加6种不同的启动子(诱导型启动子Pgrac、Pglv-M1和组成型启动子P43、Plaps、PHpaⅡ、PamyQ),考察其对LeuDH表达的影响。组成型启动子Pa myQ强化作用最明显,胞外活性为31.24 U×mL-1,是添加启动子前的3.4倍;诱导型启动子Pgrac、Pglv-M1分别用0.8 mmol×L-1 IPTG、2%的麦芽糖诱导24 h和32 h,活性仅为1.87 U×mL-1和0.82 U×mL-1,不利于表达。在效果最好的PHpaⅡ-PamyQ启动子基础上,选择添加AmyQ、SacB、PhoD、YwbN四种信号肽,效果最佳的组合为B.subtlis 168/pW6IV(双启动子PHpaⅡ-PamyQ、信号肽YwbN),胞外酶活为21.76 U×mL-1,分泌效率达到40.78%。(3)选用产LeuDH活性最好的菌株B.subtlis 168/pW6进行发酵产酶、分离纯化和酶学性质研究。7.5 L发酵罐进行发酵条件优化,产酶水平达到217.96 U×mL-1,为摇瓶水平的5.19倍。镍柱层析分离获得LeuDH纯酶的比酶活13 U×mg-1。酶学性质分析表明,酶的底物谱宽泛,对部分脂肪族氨基酸有活性,对底物L-Leucine的亲和性最好,Km为6.17 mmol·L-1,Vmax为14.49μmol·L-1·min-1;pH稳定性范围为5.0-11.0;最适温度为55℃;差示扫描微量热技术(DSC)测定酶的变性温度(Tm)为64.13℃;圆二色谱(CD)变温扫描分析酶二级结构的改变,发现α螺旋含量随温度升高逐步下降。