目的:随着埃德蒙顿抗免疫排斥方案的建立及完善,胰岛移植有望成为临床治疗1型糖尿病最有效的方法之一。胰岛移植具有操作安全、手术创伤小以及操作简单等优点,但目前临床上供胰短缺、需要终生使用免疫抑制药物及胰岛移植物长期存活率低等问题限制了胰岛移植的进一步发展和广泛应用。在临床胰岛移植中,为了保证供体胰岛的质控、移植受体的免疫诱导、胰岛的跨区域转运以及进一步降低胰岛移植后白细胞介导的反应等,胰岛在移植给受体前通常需要在体外培养24-72小时,目前大多数临床胰岛移植中心采用移植前体外培养48小时为胰岛移植的标准方案。临床上移植前胰岛的培养基添加物是人血清白蛋白（human serum albumin）,虽为胰岛提供了必要的渗透压条件,但缺乏血清中大量的有益于胰岛存活的因子和营养物质,使移植前培养的胰岛处于血清剥夺的应激状态中。研究表明,有多达20%的胰岛在移植前体外培养阶段丢失,造成了胰岛移植中移植物数量不足并进一步加剧了供胰短缺等问题,影响胰岛移植治疗糖尿病的效果。因此,预防和减少血清剥夺应激引起的胰岛凋亡,保护胰岛活性和功能,可以提高胰岛移植的效率。人羊膜提取物（human amniotic membrane extract）是一种安全可靠且来源丰富的生物材料,目前临床上已被应用于角膜等疾病的治疗。研究表明,人羊膜提取物具有促进组织修复愈合、抵抗乏氧应激损伤,保护细胞活性和功能等生物特性,同时由于人羊膜提取物含有丰富的细胞生长因子,有利于细胞的增殖。因此,本研究拟构建小鼠原代胰岛移植前体外培养胰岛血清剥夺应激模型,通过系列实验验证人羊膜提取物对血清剥夺应激下小鼠原代胰岛的保护作用,探索人羊膜提取物对胰岛保护作用可能的分子机制,为临床胰岛移植及移植前胰岛保存领域提供一种新思路。研究方法:1.收集健康剖宫产孕妇人羊膜并制备人羊膜提取物;利用Bradford试剂盒检测人羊膜提取物总蛋白含量。2.利用AO/EB试剂盒,检测人羊膜提取物在不同浓度（0-1.5 mg/m L）下对体外培养48小时后血清剥夺应激胰岛活性的影响。3.利用TUNEL试剂盒,检测人羊膜提取物在不同浓度（0-1.5 mg/m L）下对体外培养48小时后血清剥夺应激胰岛凋亡的影响。4.利用超敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒,检测人羊膜提取物在不同浓度（0-1.5 mg/m L）下对体外培养48小时后血清剥夺应激胰岛细胞胰岛素分泌功能的影响。5.利用Western Blot检测添加人羊膜提取物培养后胰岛细胞中Akt、ERK1/2蛋白及其磷酸化表达水平。6.利用Western Blot检测添加人羊膜提取物培养后胰岛细胞中Bcl2、BAX、Cleaved Caspase-3等凋亡相关蛋白表达水平。7.利用链脲佐菌素（STZ）构建雄性C57BL/6小鼠糖尿病同系移植受体模型。8.利用肾被膜下注射进行胰岛肾被膜下移植。9.利用非禁食血糖、体重监测及腹腔注射葡萄糖糖耐量实验（IPGTT）评价胰岛移植的效果。10.利用HE染色、免疫组化染色及免疫荧光染色观察胰岛移植物组织形态学特征。11.利用超敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒,检测胰岛移植物胰岛素含量。12.利用蛋白LC-MS/MS鉴定分析,检测人羊膜提取物中蛋白质丰度及蛋白质成分。13.利用ELISA试剂盒,检测人羊膜提取物中TIMP-1、EGF、HGF、IL-1RA细胞生长因子浓度。结果:1.成功制备人羊膜提取物,其总蛋白含量为2.65±0.41 mg/m L,将制备好的人羊膜提取物置于-80℃保存备用。2.体外培养48小时后,血清剥夺对照组胰岛活性明显低于正常血清组胰岛（P<0.0001）,添加人羊膜提取物显著提高血清剥夺应激胰岛的活性,在人羊膜提取物浓度为0.5 mg/m L时达到峰值（P<0.001）。3.体外培养48小时后,血清剥夺对照组胰岛凋亡明显高于正常血清组胰岛（P<0.0001）,添加人羊膜提取物显著减少血清剥夺应激胰岛的凋亡,在人羊膜提取物浓度为0.5、1.0 mg/m L时达到峰值（P<0.0001）。4.体外培养48小时后,血清剥夺对照组胰岛细胞在高糖（16.8 m M）刺激下胰岛素分泌功能较正常血清培养组胰岛明显下降（P<0.0001）,但两组在低糖（2.8 m M）下的胰岛素分泌量无明显差别;添加人羊膜提取物不影响胰岛细胞在低糖（2.8 m M）下胰岛素分泌量,但在添加浓度为0.5、1.0 mg/m L人羊膜提取物时能显著增加高糖（16.8 m M）刺激下胰岛细胞的胰岛素分泌量,且在人羊膜提取物浓度为0.5 mg/m L时达到峰值（P<0.0001）。5.体外培养48小时后,人羊膜提取物（0.5 mg/m L）显著提高血清剥夺应激胰岛细胞中Akt（P<0.01）、ERK1/2（P<0.001）的蛋白磷酸化水平。6.体外培养48小时后,人羊膜提取物（0.5 mg/m L）显著提高血清剥夺应激胰岛细胞中Bcl2、BAX比值（P<0.01）,且人羊膜提取物显著降低血清剥夺应激胰岛细胞中Cleaved Caspase 3的表达（P<0.01）。7.成功构建同系小鼠肾被膜下胰岛移植模型;体外培养48小时后,添加人羊膜提取物培养的胰岛相对于血清剥夺对照组胰岛具有更好的血糖控制能力（P<0.0001）;相对于血清剥夺对照组,人羊膜提取物组糖尿病受体小鼠体重明显增高（P<0.0001）;添加人羊膜提取物培养的胰岛移植后,糖尿病受体小鼠恢复至正常血糖水平的比例更高（P<0.01）。8.相对于血清剥夺对照组,添加人羊膜提取物培养的胰岛移植后具有更强的血糖清除能力（P<0.0001）。9.组织病理结果显示,添加人羊膜提取物培养的胰岛移植后能在局部定植并存活,且移植物中明显可见胰岛素和胰高血糖素阳性细胞。10.相对于血清剥夺对照组,添加人羊膜提取物培养的胰岛移植后移植物胰岛素含量明显更高（P<0.0001）。11.蛋白质谱结果表明,人羊膜提取物成分稳定,含有调节内皮细胞的增殖、血管生成、细胞凋亡、免疫调节关键蛋白质。12.人羊膜提取物中含有促进胰岛存活的关键生长因子,且-80℃超低温保存稳定（P>0.05）。结论:在48小时体外培养过程中,人羊膜提取物能明显提高血清剥夺应激胰岛的活性、降低血清剥夺应激胰岛细胞的凋亡、改善血清剥夺应激胰岛的胰岛素分泌功能,且人羊膜提取物最佳作用浓度为0.5 mg/m L;人羊膜提取物能显著提高血清剥夺应激胰岛细胞内Akt、ERK1/2蛋白的磷酸化水平;人羊膜提取物能显著提高血清剥夺应激胰岛细胞内Bcl2、BAX蛋白表达的比例,降低Cleaved Caspase 3的表达;添加人羊膜提取物培养的胰岛移植后能更有效地治疗小鼠糖尿病;人羊膜提取物成分稳定,含有调节细胞凋亡等关键蛋白,且含有促进胰岛细胞存活的生长因子。