本研究以“粉玉”体色瓯江彩鲤为对象，人工感染嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)后，一方面分析主要组织相容性复合体(Major histocompatibilitycomplex, MHC) II类α和β基因多态性及其与鱼体抗病力之间的关系；另一方面，采用RACE技术，获得补体C9基因cDNA的全长序列，并通过实时荧光定量PCR技术检测了C9基因在各正常组织及感染嗜水气单胞菌后不同时段的组织表达情况。研究结果将为“粉玉”体色瓯江彩鲤的抗病育种提供重要的基础资料。主要研究结果如下：1、MHC class IIβ基因的多态性及其与鱼体抗病力的关系从30尾感病和13尾抗病“粉玉”体色瓯江彩鲤的cDNA中扩增出长度为624bp的MHC class IIβ基因片段。对210个有效克隆进行测序，获得84个不同的编码序列，分属13个不同的等位基因，其中Cyca-DAB3*17和Cyca-DAB3*18为新发现的2个等位基因。核苷酸、氨基酸变异位点总数为267、130，变异率较高(42.79%、62.50%)。MHC class IIβ基因片段包括第14个外显子，分别编码信号肽、β1和β2结构域及跨膜区。β1结构域的变异明显大于β2结构域，表现为在长度为276bp的β1结构域中，核苷酸、氨基酸变异位点分别为150个(54.35%)和72个(78.26%)；而长度为282bp的β2结构域的核苷酸、氨基酸变异位点较少，分别为105个(37.23%)和54个(57.45%)。在β1结构域的24个抗原结合位点(Peptide binding region，PBR)上，有22个发生了变异。β1结构域的PBR、非抗原结合位点(non-PBR)及β2结构域的非同义碱基替换率(dN)与同义碱基替换率(dS)的比值ω分别为1.366、0.992、0.792，表明“粉玉”体色瓯江彩鲤MHC class IIβ基因的β1结构域在进化过程中受到正向选择作用。基因Cyca-DAB3*09在抗病群体中出现的频率(7.81%)显著高于感病群体(1.37%，P<0.05)，新等位基因Cyca-DAB3*18(频率为3.13%)只出现在抗病群体中，基因Cyca-DAB1*08、Cyca-DAB3*08和Cyca-DAB3*17为感病群体所特有。2、MHC class IIα基因的多态性及其与鱼体抗病力的关系对43尾“粉玉”体色瓯江彩鲤的207个有效克隆进行测序，获得105条不同的MHC class IIα编码序列，分属11个不同的等位基因，Cyca-DXA13、Cyca-DXA14、Cyca-DXA15和Cyca-DXA16为新发现的4个等位基因。核苷酸、氨基酸变异位点总数为214、109，变异率较高(34.29%、52.40%)。MHC class IIα基因片段的长度为624bp，包括第14个外显子，分别编码33bp的信号肽、252bp的α1和285bp的α2结构域及54bp的连接肽/跨膜区。α1结构域的变异明显大于α2结构域，表现在α1结构域中核苷酸和氨基酸变异位点比例(40.87%和61.9%)远高于α2结构域的变异位点比例(31.58%和51.58%)。在α1结构域的21个抗原结合位点(PBR)上，有17个发生了变异。α1结构域的PBR区的非同义碱基替换率(dN)与同义碱基替换率(dS)的比值ω为5.186，远远高于非抗原结合位点(non-PBR)及β2结构域的0.796、0.531，表明“粉玉”体色瓯江彩鲤MHC class IIα基因的α1结构域在进化过程中受到正向选择作用。等位基因Cyca-DXA5和Cyca-DXA10在抗病群体中出现的频率极显著高于其在感病群体中出现的频率(P<0.01)；新等位基因Cyca-DXA15为抗病群体所特有，且出现的频率(4.62%)达到了极显著水平(P<0.01)；而等位基因Cyca-DXA8在感病群体中出现的频率(19.72%)极显著高于其在抗病群体中出现的频率(1.54%, P<0.01)。组织表达分析结果表明，MHC IIα基因在健康鱼的肝脏中表达量最高，其次是脾和肌肉，肠中的表达量最低。感染嗜水气单胞菌后，MHC IIα基因在肝和脾中的表达量均急剧下降，在感染后72h和96h又呈现上升的趋势。而肾在感染12h内表现出应急反应，表达量上升，随着时间的推移，表达量又降低。3、补体C9基因的全长克隆与表达分析补体C9是构成膜攻击复合体直接导致靶细胞溶溃的重要组成成分。我们采用RACE技术，首次成功克隆出“粉玉”体色瓯江彩鲤补体C9基因的cDNA全长。该序列全长2158bp，包括24bp的5′-UTR、2022bp的开放阅读框(Open readingframe, ORF)和112bp的3′-UTR，编码一个由674个氨基酸组成、分子量为73.16kDa的前体蛋白，第1-19个氨基酸为信号肽，在3′-UTR PolyA尾上游57bp处出现一个多聚腺苷酸加尾信号AATAAA。序列分析表明，“粉玉”体色瓯江彩鲤C9基因具有TSP、LDL-R、MACPF和EGF样等4个保守结构域。C9的蛋白序列含有28个保守的半胱氨酸残基，第256位存在一个长度为74个氨基酸的富含甘氨酸(Glycine, Gly)的区域。系统进化分析表明，“粉玉”体色瓯江彩鲤C9的氨基酸序列，与草鱼(Ctenopharyngodon idella)的相似性最高（77.5%），与其他鱼类的相似性在41.8%~44%之间，而与哺乳动物的相似性（33.5%~36.7%）则较低。半定量结果显示，C9基因在健康“粉玉”体色瓯江彩鲤的肝、脾和肾中有表达，其中肝脏中的表达量最高，其次是脾。实时荧光定量PCR检测的结果显示，感染嗜水气单胞菌后，12h内肝脏中的表达量激增，24h时又骤减，随后又增高，72h时表达量升高至正常水平的20.80倍，96h时又降到3.03倍。在脾和肾中，感染24h内表达量持续上升，24h时达到最高，随后又急剧降低，到96h时基本降为正常水平的0.5倍左右。可见，C9基因在“粉玉”体色瓯江彩鲤肝、脾和肾组织中C9基因的表达变化情况与嗜水气单胞菌的侵染紧密相关，揭示其在鱼体免疫反应中的重要作用。