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鸭疫里默氏杆菌可感染鸭、鹅、火鸡等多种鸟类引起多发性渗出性炎症和全身性败血症。家鸭感染后,以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎等广泛的纤维素性炎症为临床特征。本病在世界各地广泛分布,具有较高的发病率和死亡率,是引起养鸭业重大经济损失的传染病之一。目前,Gen Bank数据库中关于鸭疫里默氏杆菌的全基因组序列信息非常有限,并且,鸭疫里默氏杆菌的致病机制仍不清楚。为了更好地研究鸭疫里默氏杆菌的遗传规律和致病机制,本研究测定了血清2型鸭疫里默氏杆菌强毒菌株Yb2的全基因组序列,并采用转座子随机诱变技术在全基因组范围内对鸭疫里默氏杆菌毒力基因进行了鉴定和功能分析。本研究运用Illumina Miseq测序平台对鸭疫里默氏杆菌Yb2株进行全基因组序列测定,经序列拼装和基因缺口修补,最终得到一条完整的线性基因组序列,长度为2,184,066 bp,GC含量为35.73%。Yb2基因组包含2,073个基因,38个t RNA,6个r RNA和1个其他非编码RNA。经Island View软件预测,Yb2基因组含6个基因岛,编号为GI-1GI-6。在2,021个具有明确生物学功能的蛋白中,1,214个蛋白具有COG分类,1,217个蛋白具有KEGG的ortholog。分析脂多糖合成途径蛋白,预测获得11个与脂多糖合成相关的基因,主要参与类脂A的合成。基因组比对分析发现:Yb2基因组与DSM15868、RA-GD、RA-CH-1和RA-CH-2菌株基因组的共线性区块数依次为50、29、203和42;Yb2基因组存在4个倒位同源性区块,但是并无大片段序列的重排现象。基于16S r DNA构建了鸭疫里默氏杆菌的系统发育树,其中Yb2与RA-GD处于同一分支,表明它们之间亲缘性最高。通过接合转导的方式,将转座子Tn4351随机插入到Yb2基因组,并通过红霉素和卡那霉素双抗筛选和PCR扩增鉴定,构建了共含有突变株3,175株的转座子随机突变库。以野生株Yb2的100 LD50作为攻毒剂量感染樱桃谷鸭,筛选不引起雏鸭发病死亡的突变株,共获得100株减毒突变株。Southern blot分析获得62株单一插入位点的减毒突变株,通过反向PCR和染色体步移技术共鉴定到49个插入失活基因。将鉴定的基因进行比对、COG分类和膜定位分析,结果表明:在鉴定的49个基因中,25个（51%）基因编码胞浆蛋白,6个（12%）基因编码胞浆膜蛋白,4个（8%）基因编码外膜蛋白,其余14个（29%）基因的编码产物的亚细胞定位未知。通过比对数据库进行COG功能分类,这些基因编码的蛋白中,16个蛋白与“metabolism”相关,6个蛋白与“cellular processing and signaling”相关,4个蛋白归类于“information storage and processing”,其他23个蛋白的COG分类未知。测定了22株减毒突变株的LD50,结果表明:通过动物实验筛选的突变株,其毒力均有不同程度的减弱,且至少比野生株Yb2减弱100倍。通过玻片凝集试验筛选减毒突变株,获得1株失去血清凝集能力的突变株,命名为RA2640。Southern blot表明转座子在RA2640基因组中仅有一个插入位点,测序显示插入失活的基因为AS8704050。q RT-PCR分析结果显示转座子的插入不影响AS8704050上、下游基因的转录水平,表明突变株RA2640生物学特性的改变源于AS8704050基因的功能失活。RA2640能被结晶紫着染,表明其LPS表型由光滑型转变为粗糙型。SDS-PAGE分析纯化的LPS,结果显示RA2640的LPS在分子量为13 k Da、20 k Da处有目的条带,而野生株Yb2的LPS在分子量为13 k Da、20 k Da和25 k Da处有目的条带,即突变株RA2640合成不完整的LPS,表明AS8704050基因参与LPS的合成。突变株RA2640对抗生素、去污剂（Triton X-100）、消毒剂（H2O2）和健康鸭血清的敏感性显著地高于野生株,表明LPS的完整性在细菌抵抗力方面发挥着重要的作用。对突变株RA2640黏附、入侵Vero细胞的能力进行测定,结果表明RA2640的黏附、入侵能力均显著高于野生株,可能粗糙型细菌黏附、入侵细胞的机制不同于光滑型细菌。应用18日龄樱桃谷鸭对突变株的毒力进行检测,其LD50测定为1.91×1010 CFU,表明其毒力下降约100,000倍（野生株Yb2的LD50为1.07×105 CFU）。更重要的是,RA2640感染18日龄樱桃谷鸭后,不能在其体内存活,在感染后3 h就能被机体清除,而相同剂量的野生株感染雏鸭,3 h后血液载菌量为2.51×104 CFU/m L,24h后可达6.04×106 CFU/m L。回复株c RA2640能全部或部分回复抗生素敏感性、去污剂及消毒剂抵抗性、健康鸭血清抵抗力、黏附入侵能力、致病性等生物学特性至野生株水平,表明AS8704050基因与鸭疫里默氏杆菌LPS的合成及致病性相关。简言之,本研究完成了血清2型鸭疫里默氏杆菌强毒菌株Yb2的全基因组序列测定,并与Genbank公布的其他4株鸭疫里默氏杆菌进行了序列比对分析。首次采用转座子随机突变技术在全基因组范围对鸭疫里默氏杆菌毒力相关基因进行鉴定,获得49个毒力相关基因,并证实AS8704050基因与鸭疫里默氏杆菌LPS的合成及致病性相关。