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绿僵菌在各种农业害虫的生物防治方面发挥着非常重要的作用,并具有良好的发展前景。目前的研究主要集中于绿僵菌体表侵染,对于消化道侵染的研究相对较少。胞外蛋白酶作为重要的毒力因子,在绿僵菌侵染过程中发挥着重要的作用。前期研究发现,单独饲喂绿僵菌后,飞蝗中肠微绒毛结构脱落,而饲喂含有绿僵菌和TPCK的饵剂后,中肠表皮微绒毛结构完整。本文为了验证胞外蛋白酶在飞蝗中肠中的破坏作用,揭示胞外蛋白酶对飞蝗中肠免疫反应的影响,克隆表达了绿僵菌胞外蛋白酶Pr1C、Pr1J,通过饵剂饲喂的方式验证了它们对飞蝗中肠免疫反应的影响,为进一步揭示绿僵菌的作用机制提供了理论依据。主要研究结果如下:1.绿僵菌胞外蛋白酶作用分析绿僵菌及胞外蛋白酶抑制剂处理飞蝗后,对飞蝗中肠样本进行转录组测序分析。差异基因分析结果显示,以P<0.05为标准筛选差异基因并对其分析发现,IPPM202和IPPM202+TPCK之间筛选到70个差异基因,有22个基因的表达上调,48个基因下调,上调的差异基因主要与昆虫的生长发育相关,下调的基因富集到PI3K/Akt信号途径,该途径与昆虫先天性免疫反应途径密切相关,表现为飞蝗免疫反应的抑制,从而推断胞外蛋白酶在飞蝗中肠免疫反应中起关键作用。2.胞外蛋白酶基因的克隆表达及对飞蝗生物活性测定从绿僵菌转录组中筛选得到了两种胞外蛋白酶基因Pr1J和Pr1C,对两种胞外蛋白酶基因序列分析结果显示,该基因序列全长分别为1215bp和2124 bp,分别编码含有405个氨基酸和707个氨基酸的蛋白序列,且与类枯草杆菌蛋白酶具有很高的同源性,分别达到99%和97%,对两个基因的相似性分析发现,二者均含有肽酶S8(Peptidase_S8)结构域。通过分离克隆和原核表达获得了两种胞外蛋白酶,饵剂饲喂试验发现两种胞外蛋白酶均能增强绿僵菌毒力,导致飞蝗存活率降低。3.胞外蛋白酶对飞蝗免疫的影响。饲喂含有胞外蛋白酶和绿僵菌的饵剂后,测定了飞蝗中肠保护酶、解毒酶类、以及免疫相关基因表达量的变化。结果发现,绿僵菌胞外蛋白酶Pr1J或Pr1C与绿僵菌混用都能够使飞蝗保护酶及解毒酶活性显著升高;然而,随着处理时间的延长,酶活性逐渐降低。绿僵菌胞外蛋白酶Pr1J、Pr1C与绿僵菌混用后,飞蝗中肠免疫Toll和Imd途径关键基因表达量均呈上升趋势;其中第2、4天,Pr1J、Pr1C与绿僵菌混用处理飞蝗中肠免疫基因表达量明显高于其他处理;第6天,Pr1J、Pr1C与绿僵菌混用飞蝗中肠基因表达量则明显低于绿僵菌单独处理。因此,胞外蛋白酶Pr1J、Pr1C能够诱导蝗虫增加对绿僵菌的免疫力,但随着时间的延长免疫力逐渐降低。