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目的：本课题主要探讨HL60细胞增殖分化过程中HOXA6mRNA的表达及HOXA6蛋白的分泌情况,用三氧化二砷(ATO)和／或全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)进行干预,在基因水平探讨ATO和／或ATRA对HL60细胞增殖分化过程中HOXA6mRNA的表达及HOXA6蛋白的分泌的影响。方法：1.HL60细胞株(购自维康生物有限公司)2.实验分组。实验分4组：(1)空白对照组：HL60细胞对数生长期收集细胞并调节细胞数至1×105/ml,加以等量的RPMI 1640。(2) ATRA组：在培养体系分组中加入12ulATRA,终浓度1×10-6mol/l。(3)(3)ATO组：在培养体系分组中加入ATO,终浓度为1×10-6mol/l。(4) ATRA+ATO组：加入ATRA、ATO,终浓度同上。3.采用肿瘤细胞体外培养技术,以ATO和(或)ATRA持续干扰人类HL60细胞,观正常组、ATRA组、ATO组、ATRA+ATO组的HL60细胞第1天,2天和3天的分化情况。4.采用瑞氏姬姆萨染色法鉴定HL60细胞。5.第1天、第2天、第3天分别提取各组细胞总RNA,用1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA分子的完整性。6.通过随机引物将总RNA逆转录为cDNA,采用实时荧光定量逆转录多聚酶链反应(fluorogenic quantitive reverse transcription polymerize chain reaction, FQ-RT-PCR)技术检测HL60细胞增殖分化过程中各组HOXA6基因的表达。7.随机抽取逆转录的HOXA6基因进行电泳分别获得HOXA6基因在1天、2天、3天电泳图。将HOXA6基因cDNA和ACTB基因阳性产物cDNA梯度稀释制作各自的标准曲线,根据各个样本循环指数增长期的起始点即循环域值(cycle threshold,Ct)和标准曲线斜率计算各自样本起始cDNA模板量倍数值,以ACTB基因作为内参照进行标化。8.PCR统计方法：结果用DNA相对拷贝数和RNA表达相对量(2-△Ct)表示HOXA6基因相对内参基因的表达量,采用均数加减标准差x±s)表示HOXA6基因的变化情况。进行方差齐性检验,REPEATED MEASURE方差分析,由统计学软件SPSS10.0完成。9.第1天、第2天、第3天分别裂解细胞提取各组细胞总蛋白。10.蛋白免疫印迹法(Western-blot):分别检测各组细胞中的HOXA6蛋白的表达：用BCA试剂盒测定样品总蛋白浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、考马斯亮蓝染色观察蛋白条带、电转移(electrotransfer)、封闭PVDF膜、免疫反应(加入一抗和二抗)、化学发光显示目的条带。11.图像分析：将Western-blot结果传送至计算机,用QUANTITY ONE图像分析软件系统对蛋白条带进行分析,得到积分光密度值,用内参做校正,积分光密度值比值,代表蛋白相对表达量。12.Western-blot统计方法：分析各组细胞中HOXA6蛋白表达的差异,所有数据用x±s,采用REPEATED MEASURE方差分析,P<0.05有统计学意义,P<0.01为显著差异。结果：1.HL60细胞的形态学鉴定,瑞氏姬姆萨染色法证明所培养的细胞是HL60细胞,并可见药物处理组明显的粒系分化细胞。2.1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳显示RNA电泳图的5s,18s,28s三条带型整齐,无明显拖尾及弥散,说明RNA结构完整,无明显降解。3.逆转录PCR扩增三组均有目的基因HOXA6和内参照ACTB基因的cDNA的产物,与DNA分子Marker相比示扩增产物大小分别为：H0XA6为126bp,ACTB基因为111bp,与预定理论值大小符合。4.不同浓度ATRA处理细胞24h后,除5×10-6mol/l外其它浓度均会明显抑制细胞增殖,并随浓度的增加抑制作用也越显著。不同浓度ATO处理细胞后,除10-7mol/l外其它浓度均会明显抑制细胞增殖,并且浓度越大抑制作用出现的越早,效果越明显。不同浓度ATRA、ATO联合处理细胞后,均会明显抑制细胞增殖,并且浓度越大抑制作用出现的越早,效果越明显。5.空白对照组HOXA6mRNA和HOXA6蛋白在HL60细胞中的表达呈逐渐增高的趋势。6.ATRA组HOXA6mRNA和HOXA6蛋白表达增强,均高于正常组,其中第2天表达最强烈,第3天减弱。7.随时间推移,ATO组和ATO+ATRA组HOXA6mRNA和HOXA6蛋白的表达在第1天最强烈(高于正常组),第2天和第3天表达下调(低于正常组)。8.与正常对照组比较,HOXA6mRNA和HOXA6蛋白受ATRA (1×10-6mol/L)上调,而受ATO和ATO+ATRA先上调,然后下调。结论：1.1×10-6mol/L的ATRA、ATO及ATRA+ATO在诱导时间内能促进HL60细胞向成熟细胞分化。2.HOXA6基因、HOXA6蛋白在人髓性白血病细胞HL60细胞增殖过程中有表达,随着时间的推移表达增加,提示ATRA治疗白血病的机制可能与调节HOX基因的表达有关。3.ATRA (1×10-6mol/L)在诱导时间内能上调HOXA6基因和HOXA6蛋白的表达,提示ATRA治疗白血病的机制可能与调节HOX基因的表达有关。4.ATO (1×10-6mol/L)在HL60细胞分化过程中能使HOXA6基因和HOXA6蛋白表达下调,提示ATO治疗白血病的机制可能是通过调控HOXA6基因表达下调促进细胞分化成熟。