皮肤过敏性疾病是高发的变态反应型疾病,是当皮肤暴露于外界过敏原时,由全身免疫系统参与而症状产生于局部的病理过程。除了在普通人群中常见外,对于在边防、海岛等恶劣环境下进行工作与生活的部队官兵,特别如遇战事、灾害等严峻情况,影响尤为严重。因此,深入探讨皮肤变态反应性疾病的病理过程与机制,发现新的药物作用靶点和新的治疗药物,具有重要的科学价值与军事意义。变态反应型疾病发病的确切机制目前仍不十分清楚,但炎症细胞的募集是最终导致过敏性炎症发生和发展原因。嗜酸粒细胞(eosinophils, Eos)是过敏性疾病中重要的效应细胞,其浸润于过敏部位,释放毒性蛋白,造成组织损伤,导致炎症发生。造成Eos局部浸润的最重要的趋化因子是嗜酸粒细胞趋化因子(eotaxin/CCL11),因此eotaxin的表达与调控是过敏性疾病的重要环节和药物治疗靶点。Eotaxin参与了皮肤过敏性疾病(如特异性皮炎、接触性皮炎、药物过敏性皮肤疾病等)的进程已得到证实。而人体皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成,eotaxin在过敏皮肤中的确切表达部位及表达的动态过程目前还没有证实。本研究中,我们以小鼠接触性皮炎(ACD)模型为基础,探讨了eotaxin在过敏环境下皮肤中的表达部位及动态特征。同时对皮肤过敏反应的免疫学特征进行了观察,我们对CD4+和CDS+T淋巴细胞的浸润的程度和时程进行了比较。此外,为了阐明eotaxin表达的调控机制,我们以构成表皮层的角质形成细胞(KC)株HaCaT细胞和构成真皮层的真皮成纤维细胞(FBs)为基础,使用TNF-a和IL-4刺激两种细胞,观察eotaxin分泌量的改变,并检测与两种因子相关的转录因子NF-κB和STAT6的激活情况,探讨eotaxin表达的转录机制。皮肤过敏性疾病的治疗是本课题关注的重要内容。相对于化学药物治疗,传统药物更显示出开发成本低、疗效好、副作用少、重视免疫平衡等优点。苦参方为一治疗过敏性皮肤病的传统中医药方剂,其提取物的主要成份为苦参碱(Mat)、氧化苦参碱(Omt)、槐果碱(Sop)、氧化槐果碱(Osp)以及荆芥挥发油(SVO)。我们考察了苦参方提取物(KS)凝胶剂对小鼠接触性皮炎的治疗效果,同时检测其对eotaxin的抑制作用,并于细胞水平对其提取物抑制TNF-a和IL-4诱导的eotaxin表达的信号转导机制进行进一步阐述。基因治疗是目前疾病治疗的一个研究热点,我们尝试性地对皮肤过敏性疾病的经皮基因治疗进行了探索。微乳是经皮给药的一个良好剂型,将经稳定性修饰的eotaxin特异性siRNA制成W／O型微乳剂型,经皮给药,观察其对小鼠接触性皮炎治疗效果及对eotaxin的在皮肤组织中表达的抑制作用。第一部分：Eotaxin在皮肤过敏性疾病中的表达调控(一) Eotaxin在小鼠接触性皮炎(ACD)中的表达规律研究1.小鼠接触性皮炎模型的建立：以BALB/c小鼠为模型动物,用DNFB涂抹鼠耳,于第1、2天致敏和强化致敏,第5天激发,可造成鼠耳皮肤过敏反应；小鼠耳肿胀度呈现一动态过程,肿胀高峰出现在24h-48h,肿胀度可达0.26±0.04mm,炎症待续5天左右,皮肤组织病理检测结果、血液炎症细胞计数证实了这一结论。其中Eos计数检测中,激发前小鼠血Eos为0.19±0.042×107/L,激发后于1h-2h开始升高(1.94±0.12×107/L),至24h达到最高(6.63±1.12×107/L),72h开始减弱至5d恢复正常。此外,采用流式细胞术检测血中CD4+和CD8+T细胞数量比,免疫组织化学方法检测组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞的量,发现在过敏进程中,血液和组织中的CD4+和CD8+T细胞数量都有不同幅度的增长。2.采用原位杂交实验技术检测小鼠过敏皮肤中eotaxin mRNA表达情况,观察到其主要产生于真皮层,少量产生于表皮层,同时血管内皮和软骨组织也有表达,由此证明真皮成纤维细胞是eotaxin在过敏状态下的主要来源。3.分别采用real-time PCR、免疫组织化学和western-blotting检测法检测eotaxin在组织中表达的动态规律,及用ELISA检测血清中eotaxin的浓度。发现激发后2h在组织中已经开始有eotaxin的表达,到6h-12h表达量到最大并持续到24h,之后有所下降,到72h,基本恢复到最初状态。(二) Eotaxin在皮肤细胞中产生的调控机制研究1.采用不同浓度的TNF-α(1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL)和IL-4(2ng/mL、10 ng/mL,50ng/mL)分别与HaCaT细胞株和真皮成纤维细胞(FBs)共同孵育12h,用real-time PCR和ELISA方法检测eotaxin mRNA和蛋白表达的情况,发现TNF-α和IL-4均能上调eotaxin的表达,并呈剂量依赖性。而且无论是基础表达还是在两种细胞因子刺激下,FBs分泌eotaxin的能力远远高于HaCaT细胞。当同时使用TNF-α100 ng/mL和IL-4 10 ng/mL时,发现TNF-α和IL-4对两种细胞中eotaxin mRNA和蛋白的上调均有协同作用。2.分别或同时用100 ng／mL TNF-a和10 ng／mL IL-4与两种细胞共同孵育,用real-time PCR和流式细胞术观察eotaxin mRNA和蛋白在72h内动态表达的动力学过程,发现FBs比HaCaT细胞较早地表达eotaxin,也较快达到高峰,同时衰减也较快,而HaCaT细胞表达eotaxin则较为缓慢和平稳,可持续较长时间。3.通过EMSA和western-blotting分别检测转录因子NF-κB核转位和STAT6磷酸化的情况。在两种皮肤细胞中,TNF-α和IL-4可以分别激活NF-κB和STAT6发生核转位,而NF-κB特异性拮抗剂PDTC和转录因子STAT6特异的siRNA可以抑制TNF-α和IL-4引起的eotaxin上调,从而证实两种细胞受TNF-α和IL-4刺激后,均可通过NF-κB和STAT6转录导致eotaxin的表达。本部分研究证实了eotaxin在小鼠接触性皮炎模型皮肤组织中表达有明显上调,并确定了表达的具体部位及动态过程。同时在离体细胞的研究中也证实和在体情况相似的表达特征,真皮成纤维细胞表达eotaxin的能力要高于表皮角质形成细胞。并且TNF-α和IL-4可以通过NF-κB和STAT6调节eotaxin的表达。第二部分：苦参方提取物小鼠接触性皮炎的治疗作用及对eotaxin抑制作用研究(一)苦参方提取物(KS)治疗小鼠ACD的疗效及机制研究1.苦参方治疗小鼠ACD疗效观察：采用检测小鼠耳厚度的方法观察药物治疗效果。致敏前耳厚度：0.37±0.03 mm；致敏24h：0.66±0.05 mm；1%苦参方凝胶干预组：0.47±0.04 mm；5%苦参方凝胶干预组：0.49±0.06 mm；西替利嗪干预组：0.50±0.04 mm；地塞米松干预组：0.41±0.04 mm。证实苦参方凝胶组可以显著改善小鼠耳肿胀度(P<0.01)。同时通过HE染色的病理切片观察,也充分证明了药物对炎症细胞浸润的改善作用。2.采用流式细胞术和免疫组化分别对血液和组织中CD4+和CD8+的T淋巴细胞进行了检测,考察苦参方对机体免疫状态的调节作用。证明苦参方可以调节机体的免疫状态,可降低CD4+和CD8+T细胞的组织浸润和在血液中的募集。3.小鼠全血Eos计数检测。苦参方凝胶组可以显著降低过敏导致的小鼠Eos升高(P<0.01),小鼠致敏前Eos计数：0.19±0.04×107/L；致敏24 h：6.63±1.12×107,/L；1%苦参方凝胶干预组：4.78±0.66×107/L；5%苦参方凝胶干预组：2.24±0.58×107/L；西替利嗪组：5.22±0.73×107/L；地塞米松组：0.96±0.22×107/L4. Real-time PCR、western-blotting、免疫组化法检测eotaxin组织表达情况。结果表明苦参方凝胶剂可抑制eotaxin的表达,证明eotaxin可能为苦参方的作用靶点之一。(二)KS抑制皮肤细胞中eotaxin表达机制研究1.MTT法检测苦参提取物(KS)、荆芥挥发油(SVO)、Mat、Omt、Sop、Osp、盐酸西替利嗪(Cet)、地塞米松磷酸钠(Dex)对HaCaT细胞和FBs生存率的影响,证明KS和SVO≤500μg/mL, Mat、Omt、Sop、Osp≤1000μM、Cet≤200μM, Dex≤100μM时,对细胞生存率无显著影响(≥90%),亦无刺激分裂和增殖作用。2.通过real-time PCR、ELISA检测KS、SVO、Mat、Omt、Sop、Osp对TNF-α和IL-4诱导HaCaT细胞和FBs产生的eotaxin的抑制作用,同时使用Cet、Dex进行干预,作为对照实验。发现KS、SVO、Mat、Omt、Sop、Osp对eotaxin均有不同程度的抑制作用,抑制程度的顺序为KS> Mat> Omt≈Sop> Osp≈SVO。3.通过EMSA和western-blotting分别检测在两种皮肤细胞中,Mat、Omt、Sop、Osp、SVO对TNF-a和IL-4诱导NF-κB和STAT6活化的抑制作用,证实Mat、Omt、Sop、Osp均可对NF-κB和STAT6的活化发生不同程度的抑制作用,但SVO只能够部位抑制NF-κB的核转位,而对STAT6磷酸化没有明显影响。本部分研究证实了苦参方提取物对小鼠接触性皮炎具有较好的治疗效果,对小鼠过敏皮肤中eotaxin的表达及Eos的募集有明显抑制作用,并可调节机体的免疫状态。并且证明苦参方提取物及其中主要有效成分可通过NF-κB和STAT6两条信号转导通路抑制TNF-a和IL-4引起的eotaxin上调。第三部分：Eotaxin特异siRNA微乳治疗小鼠接触性皮炎初步研究1. Eotaxin特异siRNA设计与筛选。设计三对小鼠eotaxin基因特异的siRNA,使用转染试剂将siRNA转染至小鼠成纤维细胞株NIH3T3,采用real-time PCR检测TNF-a诱导下eotaxin被抑制的情况,得出eotaxin siRNA UTR为敲除效果最好的siRNA.采用ELISA检测法证实siRNA抑制eotaxin分泌的效果。2. Eotaxin siRNA微乳(ESM)的制备。eotaxin siRNA经稳定性修饰(甲氧修饰：糖的2’-OH变成2’-Ome)成stable eotaxin siRNA。处方：10% stable eotaxin siRNA(40.μg/mL或200μg／mL)水溶液,16% plurol oleique cc 497,16% labrasol,58% labrafac cc。考察了微乳的粒径、zeta电位、粘度等性状,并借助冷冻蚀刻电镜观察了微乳存在的状态、使用激光共聚焦显微镜证明了经荧光修饰的ESM (FAM-ESM)的包封效果。稳定性考察证实,微乳本身可以存放于4℃、-20℃三个月不会发生性状改变。且贮存于4℃, siRNA活性可以保持3个月,贮存于-20℃可以保持4个月。3.ESM透皮动力学考察。利用小动物整体成像系统观察裸鼠FAM-ESM透过皮肤和皮下扩散的动态过程。ESM透皮吸收1h-2h可达平衡,并可在皮内维持5h左右。与水溶液皮下注射组相比,微乳组的siRNA在皮内可停留更长的时间。4.ESM药效学观察。将ESM于小鼠ACD模型激发前24h涂于鼠耳,每日3次给药,可以明显改善过敏状态下的小鼠耳肿胀程度(正常小鼠耳厚度：0.37±0.03mm,过敏小鼠(激发后24h)：0.66±0.05 mm,低剂量治疗组：0.44±0.04 mm,P<0.01；高剂量治疗组：0.46±0.06 mm,P<0.01),并无明显不良反应发生。且其对血液和组织中CD4+和CD8+T细胞的影响较小。5.ESM对eotaxin的抑制作用考察。ESM可以显著抑制过敏状态下eotaxin的上调,但对外周血Eos影响不大,且对炎症细胞的组织浸润影响较小。而提前48h给药比提前药24h给药,在炎症过程中对eotaxin有更好的敲除效果。本部分研究制备了eotaxin特异siRNA微乳,证实了其透皮和治疗效果,ESM对小鼠接触性皮炎具有一定的治疗效果,可以显著抑制小鼠过敏皮肤中eotaxin的分泌。通过本课题的研究,进一步证实了eotaxin在过敏性皮肤疾病病理过程中的重要意义,揭示了eotaxin在过敏性皮肤疾病中的表达规律及调控机制。证明了中药方剂苦参方治疗过敏性皮肤疾病的治疗效果和作用机制。初步探讨了以RNAi为基础的治疗皮肤疾病的新的基因治疗方式。