由于造血干细胞移植过程中预处理方案对机体免疫系统的破坏,以及移植后免疫抑制剂的使用,导致机体在移植后免疫功能恢复缓慢,感染成为移植后非复发死亡的重要原因。在众多感染病原体中,EB病毒(EBV)是常见的病毒感染之一。EBV在人群中的感染率在90%以上,正常人的感染大多表现为潜伏感染的形式。但是移植后机体免疫系统失去了对EBV的监视,导致EBV再激活,引起病毒血症、肺炎、脑炎以及移植后淋巴细胞增殖性疾病(PTLD)等并发症。尤其是PTLD,虽然该病发病率低,但进展迅速,死亡率高,严重影响患者长期生存。目前对于移植后EBV的感染尚缺乏有效的治疗措施,细胞免疫治疗作为一种新型治疗方式,能够帮助机体建立抗病毒免疫,有效率高且毒副作用少,是治疗移植后EBV感染的新途径,具有很好的临床应用前景。目的:本研究的目的就是通过研究移植后发生EBV感染的人群,分析高危因素及预后特征,并应用体外制备的病毒特异性T淋巴细胞(CTL)来治疗移植后EBV感染的患者,研究该方法的安全性和有效性,为临床防治移植后EBV感染提供新思路。内容:本文的研究内容主要分三个方面。1.对我中心行造血干细胞移植的病例进行回顾性分析,对发生EBV感染人群的特征进行研究,统计患者年龄、预处理方案、移植类型、HLA相合程度、GVHD的发生情况等信息,分析EBV血症及PTLD的发生率,找出高危因素,并对感染者的预后特征加以分析。2.采用EBV特异性多肽负载的方法,由G-CSF动员后的供者干细胞采集物作为细胞来源,体外制备病毒特异性CTL(G-CTL),对其表型、功能进行检测,并与未动员供者来源的CTL(N-CTL)进行比较。3.对移植后发生EBV感染的患者进行治疗性输注,评价安全性及有效性。方法:1.回顾性研究2011年11月至2014年11月在我中心行造血干细胞移植的402例病例,采用Kaplan-Meier模型分析EB病毒感染的累积发生率及预后特征,logistic回归模型分析危险因素。2.研究中国人群HLA基因型的分布频率,找出HLA-A、HLA-B、HLA-DR位点频率高的基因型,根据HLA位点选择并合成EBV特异性抗原肽库。利用动员后供者干细胞采集物作为来源,密度梯度离心法分离PBMC,分贴壁与非贴壁细胞进行培养,贴壁细胞加入IL-4、GMCSF、TNF-α诱导向DC分化,并在第7天负载EBV特异性抗原肽,而后与非贴壁细胞混合,加入IL-2扩增。第14-21天收获细胞。而后,对收获的G-CTL细胞进行体外检测。测定DC细胞表面分子CD11c、CD80、CD86、CD83的表达情况,检测CTL细胞群中CD3+、CD3-CD56+、CD4+、CD8+细胞比例,采用胞内细胞因子染色技术(ics)检测ctl细胞在受到多肽刺激后胞内ifn-γ的分泌情况,采用cba技术检测培养上清内ifn-γ、tnf-α、颗粒酶b的分泌情况。并与采用同样培养方法得到的n-ctl细胞进行比较。3.选取移植后易发生ebv再激活的高危患者,利用其动员后供者干细胞采集物提前制备ctl,并进行冻存。当患者出现ebv血症时进行治疗性输注,每周输注1次,根据制备的ctl细胞数及临床效果决定具体的输注剂量及输注频次。对于低危或未提前制备ctl的患者,用其供者二次采集的非动员pbmc制备ctl。输注后24h内密切观察发热、皮疹等输注相关不良反应时间的发生情况,输注后的3月内监测急性gvhd的发生情况。采用pcr方法连续监测患者外周血ebv-dna的拷贝数变化,计算治疗的有效率。结果:1.共对402例移植后患者进行了统计分析,ebv血症的1年累积发生率为42%,中位发生时间为移植后50天,83.5%的感染发生在移植后的100天以内。ptld的1年累积发病率为1.45%,中位发病时间为65天。多因素logistic回归分析表明,发生ebv血症的危险因素为预处理中使用atg(p<0.001,hr9.92)和发生Ⅲ~Ⅳ°急性移植物抗宿主病(p=0.0016,hr2.42)。具有2个危险因素的患者ebv血症的1年累积发生率明显高于没有危险因素的患者(87.5%vs24.6%,p<0.001)。发生ebv血症患者的3年总生存率明显低于未发生eb病毒血症患者(58.5%vs75.4%,p<0.001)。2.(1)共合成89条ebv特异性多肽,所合成的多肽中由大部分hla-Ⅰ类表位多肽和一部分hla-Ⅱ类表位多肽组成,主要针对ebv-lmp1,lmp2,ebna1,ebna3,bzlf1,brlf1等免疫显性抗原。经验证,此多肽库对hla表位的覆盖率超过了90%。(2)经过7天的培养,贴壁细胞呈现典型的dc形态,经检测,cd11c+细胞比例为97.8%±1.8%,cd80+细胞比例为68.35%±21.3%,cd86+细胞比例为90.4%±10.5%,cd83+细胞比例为13.4%±12.3%。g-ctl收获时细胞总数平均扩增1.7倍,n-ctl平均扩增3.1倍,两者相比差异有统计学意义(p<0.01)。g-ctl中cd3+细胞比例为84.3%±8.8%,其中cd4+细胞比例为35.3%±11%,cd8+细胞比例为51.4%±12.6%,cd3-cd56+细胞比例为10.9%±6.7%;与n-ctl相比无明显差别。(3)g-ctl经ebv特异性多肽刺激后,分泌大量颗粒酶b、ifn-γ、tnf-α,分别为5807.8±2926.2pg/ml、450.4±332.9pg/ml、34±32.2pg/ml。ics检测表明g-ctl中cd3+ifn-γ+特异性细胞比例为20.7%±10.5%,其中cd8+ifn-γ+细胞比例为18.4%±10.6%;而n-ctl中cd3+ifn-γ+、cd8+ifn-γ+细胞比例分别为28.2%±17.5%、22.5%±17%,较动员组相比差异无统计学意义。3.共8例移植后发生EBV感染的患者接受了CTL输注治疗,其中7例采用动员后供者的干细胞采集物制备,1例采用供者二次采集的未动员PBMC进行制备。单次输注剂量为(2.3~35.1)×105/kg,输注总剂量为(0.87~7.89)×106/kg,输注次数为2~8次。输注24h内未见与细胞输注相关的毒副作用。1例患者发生肠道重度急性GVHD,可能与输注剂量的提高及免疫抑制剂的停用有关。6例患者外周血EBV-DNA拷贝数明显下降,达到CR,2例患者无效,总有效率为75%。结论:首先,本研究对我中心造血干细胞移植后EBV感染的危险因素及预后特征进行了分析,移植后EBV感染的发生率较高,影响患者长期生存,使用ATG与发生重度急性GVHD是发生EBV血症的危险因素。然后,我们合成了中国人群HLA特异性EBV抗原肽库,验证了其较广的覆盖率,适用于中国人群。并利用动员后供者的干细胞采集物成功制备了EBV-CTL,虽然其扩增能力不及未动员供者来源的CTL,但在细胞表型与功能上两者无明显差异。最后,我们用CTL治疗了8例患者,显示出了良好的临床疗效。除1例发生急性GVHD外,未见其他毒副作用。采用动员后供者来源的CTL治疗移植后EBV再激活的有效率较高,便于临床应用。在治疗过程中,应注意针对不同个体,确定安全的输注剂量,以减少急性GVHD发生的风险。