论文部分内容阅读
研究背景冠心病是当今全世界危害人们身体健康最常见的心脏病,位列我国心脏病住院率和死亡率之首。动脉粥样硬化是冠心病的主要病理生理变化,动脉粥样硬化的进展程度,特别是易损斑块的破裂是急性冠状动脉综合征（ACS）、冠心病猝死等急性冠心病事件的主要“导火线”。血管平滑肌细胞（VSMCs）是构成血管壁的主要细胞,其不正常地增殖、迁移及凋亡贯穿动脉粥样硬化的全过程。因此,如何有效地调节VSMCs的生理功能,已成为目前关心的热点问题。齐墩果酸（Oleanolic acid, OA）是从天然产物中提取出来的五环三萜类化合物,在我国,齐墩果酸主要用于急慢性肝炎的治疗。目前,国外研究表明:OA除对肝脏有保护作用外,在心血管系统也发挥着广泛的生物学效应,如保护心肌免于缺血再灌注损伤,调节血脂,抗动脉粥样硬化等作用。但是其作用的具体机制仍不甚清楚。血红素氧合酶-1（Heme oxygenase-1, HO-1）是机体最重要的抗氧化酶之一,正常情况下在组织中不或者低表达,当发生应激时,其表达会上调,从而发挥保护机体的作用。越来越多的实验表明,激活HO-1能调节心血管系统的功能,保护其免于各种不利刺激的损伤。最近国内外研究更表明,HO-1也参与了多种治疗心血管疾病药物的作用。因此,本课题以VSMCs为研究对象,运用现代分子生物学技术,探讨OA是否通过调节HO-1的表达来实现保护血管的作用,并探讨其可能的机制。研究方法第一部分齐墩果酸对血管平滑肌细胞中血红素氧合酶1表达的影响及与PI3K、MAPK通路的关系。取SD雄性大鼠,经手术取其胸主动脉,采用贴块法培养血管平滑肌细胞,采用α-SM-actin特异性抗体行细胞鉴定为平滑肌细胞,4-8代细胞用于实验。将VSMCs分为:①正常对照组,②OA（10μM）组,③OA（25μM）组,④OA（50μM）组;然后放入孵箱中培养12小时,后取出采用RT-PCR及Western blot检测细胞中HO-1 mRNA及蛋白表达情况,分光光度法测定HO-1活性。然后取OA最佳浓度加入VSMCs中,放入孵箱中培养指定时间后取出,采用Western blot检测细胞中HO-1的表达。将VSMCs分为:正常对照组和OA不同时间作用组,提取细胞蛋白,采用Western blot法检测细胞中磷酸化Akt及磷酸化MAPKs的表达情况。通过上一步实验确定能被OA激活的激酶,在下一步实验中采用相应的阻断剂与OA作用于细胞,分为:①正常对照组,②OA组,③OA+相应阻断剂组。干预后放入孵箱中培养指定时间后,取出提取蛋白,行Western blot法检测HO-1的表达。第二部分转录因子Nrf2在齐墩果酸调控血管平滑肌细胞血红素氧合酶1表达中的作用。将VSMCs分为:①正常对照组,②OA（10μM）组,③OA（25μM）组,④OA（50μM）组;在孵箱中培养4小时候后取出,提取细胞核蛋白,Western blot检测细胞核中Nf2的表达变化。确定OA能激活Nrf2后,加入相应阻断剂,实验分为:①正常对照组,②OA组,③OA +相应阻断剂组。在孵箱中培养指定时间后,取出提取细胞核蛋白,行EMSA检测Nrf2结合活性。将构建好的Nrf2干扰慢病毒载体转染细胞,Western blot测定Nrf2的表达,确定是否干扰成功。将VSMCs分为:①对照载体转染组,②OA +对照载体转染组,③Nrf2干扰慢病毒载体转染组,④OA + Nrf2干扰慢病毒载体转染组。采用Western blot法检测细胞中HO-1的表达变化。第三部分齐墩果酸对血管平滑肌细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制实验先采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）确定过氧化氢（H2O2）诱导血管平滑肌细胞损伤的最佳浓度,然后实验分为:①正常对照组,②H2O2组,③OA + H2O2组,④OA + H2O2 + ZnPP组,⑤OA + H2O2 +相应阻断剂组。采用MTT、Hoechst 33342法或流式细胞仪检测细胞凋亡及坏死情况。然后将实验分为:①正常对照组,②过氧化氢（H2O2）组,③OA（10μM）+ H2O2组,④OA（25μM）+ H2O2组,⑤OA（50μM）+ H2O2组。采用相应试剂盒测定细胞中谷胱甘肽（GSH）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）及超氧化物歧化酶（SOD）的变化。研究结果（1）OA在10、25、50μM浓度范围内都能上调VSMCs中HO-1的活性、mRNA及蛋白水平,呈现浓度依赖性,并且在50μM浓度时,OA诱导VSMCs中HO-1表达的作用最强,故此以后实验均采用50μM浓度进行细胞干预。（2）OA作用于VSMCs不同时间后,HO-1蛋白表达呈现不同程度地上调,6小时时HO-1表达最强,随后,HO-1蛋白表达逐渐减弱。（3）OA作用于VSMCs后,能使细胞中磷酸化的Akt、ERK及p38激酶表达增强。细胞分别经PI3K抑制剂wortmannin,ERK抑制剂PD98059及p38抑制剂SB203850预处理后,Western blot显示wortmannin及PD98059预处理组较单纯OA组的HO-1表达显著下调;SB203850预处理组的HO-1表达与单纯OA组比无显著变化。（4）不同浓度的OA作用于VSMCs 4小时,能激活细胞中Nrf2的核转录,且呈现浓度依赖性。细胞分别经wortmannin及PD98059预处理后,与单纯OA组比较,细胞中Nrf2结合活性显著减弱。（5）Nrf2干扰慢病毒成功瞬时转染VSMCs,Nrf2 siRNA转染组与control siRNA组比较,细胞核Nrf2表达显著减弱;OA + Nrf2 siRNA组与OA + control siRNA组比较,HO-1蛋白表达显著下调。（6）不同浓度的H2O2作用于VSMCs 24小时,能导致细胞不同程度的死亡,并呈现浓度依赖性,当浓度达到400μM时开始出现显著的细胞毒性作用,故此以后实验采用400μM H2O2作用于细胞。与H2O2组比较,OA各剂量组细胞GSH、NADPH及SOD含量均有不同程度的上升,其中25、50μM组具有统计学意义。与OA+ H2O2组相比,经ZnPP（HO-1活性抑制剂）、wortmannin及PD98059预处理组,细胞活性显著降低。结论（1）OA能上调大鼠血管平滑肌细胞中HO-1的mRNA及蛋白表达,伴有HO-1活性的增强。（2）OA通过激活大鼠血管平滑肌细胞Akt、ERK通路诱导HO-1的表达。（3）OA能激活大鼠血管平滑肌细胞中Nrf2转录因子,Akt及ERK通路参与其中。（4）Nrf2转录因子参与了OA诱导的HO-1表达。（5）OA能减轻H2O2导致的大鼠血管平滑肌细胞氧化损伤,可能是通过增加HO-1等抗氧化酶的活性来实现的。由此可见,OA通过激活大鼠血管平滑肌细胞中Akt及ERK信号通路,导致Nrf2的核转录增加,Nrf2的激活促进了HO-1的表达增加,从而减轻H2O2导致的VSMCs氧化损伤。