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研究背景:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,在女性恶性肿瘤发病率中占据主要地位,乳腺癌的发病率也逐年增高。乳腺癌是中国女性最常见恶性肿瘤,中国乳腺癌新增病例数占全球的12.2%,中国乳腺癌死亡人数占全球乳腺癌死亡人数的9.6%。约90%的乳腺癌死亡患者是由远处转移引起。因此深入探究乳腺癌发生远处转移的机制并找到预防其远处转移的靶点对改善乳腺癌患者预后有非常重要的意义。阿司匹林(aspirin)是一种非甾体类抗炎药诞生于1899年,最早用于解热镇痛,现多用于预防血栓等疾病。1968年Gasic首次提出aspirin在肿瘤预防和治疗中的潜在作用,并提出阿司匹林可预防肿瘤的远处转移,随后的动物实验、流行病学调查研究及临床试验研究证实,阿司匹林对减少乳腺癌、消化道肿瘤、前列腺癌、肝癌等肿瘤的发生发展有重要的影响,但其具体机制仍未得到阐明。继往临床研究发现血小板增多可影响肿瘤预后,之后的研究发现活化的血小板可与肿瘤细胞作用分泌多种细胞因子,影响肿瘤细胞基因表达,使肿瘤细胞发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition EMT),继而增加肿瘤细胞侵袭和转移能力。研究目的:探讨阿司匹林对血小板诱导乳腺癌MCF-7细胞上皮间质转化和迁移侵袭能力的影响。研究方法:1、阿司匹林对MCF-7乳腺癌细胞的增殖影响(1)使用CCK-8检测不同浓度阿司匹林对MCF-7乳腺癌细胞增殖的影响。2、阿司匹林、花生四烯酸激活的血小板及不同浓度阿司匹林预处理花生四烯酸激活的血小板分别干预MCF-7细胞后,对肿瘤细胞发生上皮-间质转化的影响。(1)实验分组a、空白对照组(control group):加入等体积1640培养基;b、低浓度阿司匹林组(low aspirin group):加入终浓度为0.5mmol/l的阿司匹林;c、高浓度阿司匹林组(high aspirin group):加入终浓度2mmol/l的阿司匹林;d、花生四烯酸(Arachidonic Acid)激活的血小板(Platelet)组(platelet group):加入花生四烯酸终浓度为20μmmol/l,血小板终浓度为150000个/μl;e、低浓度阿司匹林预处理花生四烯酸激活的血小板组(low aspirin+plateletgroup):加入0.5mmol/l阿司匹林、20μmmol/l花生四烯酸及血小板;f、高浓度阿司匹林预处理花生四烯酸激活的血小板组(highaspirin+plateletgroup):加入2mmol/l阿司匹林、20μmmol/l花生四烯酸及血小板。(2)按实验分组方法干预后,倒置显微镜下观察肿瘤细胞的形态变化。(3)Western Blot检测肿瘤细胞上皮-间质转化标记蛋白E-cadherin及Vimentin的表达。3、阿司匹林、花生四烯酸激活的血小板及不同浓度阿司匹林预处理花生四烯酸激活的血小板分别干预MCF-7细胞后对肿瘤细胞的迁移侵袭能力的影响。(1)按实验分组干预肿瘤细胞后采用划痕实验、Transwell实验检测MCF-7细胞迁移侵袭能力。研究结果:1、0.5mmol/l-2mmol/l的阿司匹林对MCF-7细胞增殖无影响,阿司匹林浓度≥5mmo/l时对MCF-7细胞的增殖有明显抑制作用。2、阿司匹林、活化血小板及阿司匹林干预血小板活化后对MCF-7细胞上皮-间质转化的影响:(1)细胞形态变化:空白对照组细胞为多角形上皮样细胞形态,花生四烯酸激活的血小板组细胞转变为长梭形的间质样细胞形态。低浓度和高浓度阿司匹林预处理花生四烯酸激活的血小板组细胞以多边形为主。低浓度和高浓度阿司匹林单独处理组细胞形态也为多角形上皮样细胞形态。(2)肿瘤细胞上皮-间质转化标记蛋白的表达变化:活化的血小板处理后与对照组相比E-cadherin表达显著减少(P<0.01),Vimentin的表达显著增加(P<0.01)。阿司匹林预处理血小板活化后干预MCF-7细胞,E-cadherin表达显著增高(P<0.01),Vimentin的表达显著减少(P<0.05)。阿司匹林单独处理后的MCF-7细胞E-cadherin及Vimentin的表达亦无显著改变(P>0.05)。以上结果提示:活化的血小板与MCF-7细胞共培养后可诱导其发生EMT;阿司匹林预处理花生四烯酸活化的血小板后,阿司匹林可抑制血小板介导的MCF-7细胞的EMT。3、阿司匹林、活化血小板及阿司匹林干预血小板活化后对MCF-7细胞迁移侵袭能力的影响:(1)细胞划痕实验提示:活化血小板处理组划痕闭合分数较对照组显著增大(P<0.05)。低浓度和高浓度阿司匹林预处理血小板组的划痕闭合分数较活化血小板处理组显著减小(P<0.05、P<0.01),低浓度和高浓度阿司匹林单独处理组划痕闭合分数与对照组无显著差别(P>0.05、P>0.05)。(2)Transwell检测MCF-7迁移能力:活化血小板处理组肿瘤细胞迁移能力较对照组显著增强(P<0.01)。低浓度和高浓度阿司匹林预处理血小板组肿瘤细胞迁移能力较活化血小板处理组显著减弱(P<0.01、P<0.01),低浓度和高浓度阿司匹林单独处理组肿瘤细胞迁移能力与对照组相比无显著性差异(P>0.05、P>0.05)。(3)Transwell检测MCF-7侵袭能力:活化血小板处理组肿瘤细胞侵袭能力较对照组显著增强(P<0.01)。低浓度和高浓度阿司匹林预处理血小板组肿瘤细胞侵袭能力较活化血小板处理组显著减弱(P<0.01,P<0.01),低浓度和高浓度阿司匹林单独处理组肿瘤细胞侵袭能力与对照组相比无显著性差异(P>0.05,P>0.05)。研究结论:活化的血小板与MCF-7细胞共培养后可诱导其发生EMT,进而增强其迁移侵袭能力,阿司匹林则可通过抑制环氧合酶活性减少血小板活化,进而抑制活化血小板诱导MCF-7细胞EMT及迁移侵袭能力。