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近年来,随着养猪业的发展,与之伴随的疾病也越来越复杂。猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)和猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)在临床养殖过程中常出现混合感染,且PCV2感染后会使猪产生免疫抑制,容易激发或并发其他传染病原,副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)是一种典型的“机会主义”病原,常作为继发病原伴随PCV2导致混合感染。准确而快速的诊断这几种病原,从而提供针对性的治疗,对养猪业的健康发展意义重大。荧光定量PCR检测技术具有灵敏度高、特异性强、快速、简便、能定量等优点,广泛应用于病原诊断。本研究拟建立一种三重实时定量PCR检测方法,并结合熔解曲线分析,实现对PPV、PCV2和Hps单独或混合感染的快速诊断。为此,做了以下研究:(一)分别建立了PPV,PCV2,Hps的荧光定量PCR检测方法。根据PPV的VP2基因、PCV2的cap基因和Hps的infB基因保守区域设计特异性引物,并将扩增片段克隆载体后构建质粒标准品。以不同稀释度的标准品为模板进行SYBR GreenΙ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了三种荧光定量PCR检测方法。该方法对三种病原的检测灵敏性分别是146拷贝/μL、121个拷贝/μL和72个拷贝/μL,三对引物均不与其他常见病原存在交叉反应,重复性和特异性较好,可用于临床组织病料检测。(二)建立了可同时检测PPV和PCV2的双重荧光定量PCR检测方法。利用上述PPV与PCV2特异性引物及纯化后的重组质粒作为模板,通过调节引物浓度、退火温度等条件,建立了PPV与PCV2双重SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR检测方法。该方法的灵敏性可达167拷贝/μL和140拷贝/μL,引物与其他病原无交叉反应,特异性和重复性较好,临床组织病料检测结果与普通PCR一致,证明该方法可为快速鉴别诊断这两种病毒的混合感染提供技术支持。(三)建立了可同时检测PPV和Hps的双重荧光定量PCR检测方法。利用上述PPV与Hps特异性引物及纯化后的重组质粒作为模板,通过调节引物浓度、退火温度等条件,建立PPV与Hps双重SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR检测方法,通过对该方法的灵敏度、特异性、重复性和临床组织病料检测验证,证明该方法可用于这两种病原的快速鉴别诊断。(四)建立了可同时检测PCV2和Hps的双重荧光定量PCR检测方法。利用上述PCV2与Hps特异性引物及纯化后的重组质粒作为模板,调节引物浓度、退火温度等条件,建立了PCV2与Hps双重SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR检测方法。通过对该方法的灵敏度、特异性、重复性和临床组织病料检测验证,结果表明该方法可用于这两种病原的快速鉴别诊断。(五)建立了可同时检测PPV、PCV2和Hps的三重荧光定量PCR检测方法。利用上述PCV2、PPV与Hps三对特异性引物及纯化后的重组质粒作为模板,调节引物浓度、退火温度等条件,建立PCV2、PPV与Hps三重SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR检测方法,可在同一条熔解曲线上产生了3个特异性的Tm峰值,且不与其他病原发生交叉反应,具有良好的重复性和特异性,为快速诊断这三种疾病提供技术支持,也为这三种疾病的免疫程序修订提供依据。