论文部分内容阅读
北五味子（Schisandra chinensis（Turcz.）Baill）是我国北方的一种特色植物,种植面积较大,其含有的五味子乙素具有多种生物活性,如抗氧化、抗炎抗癌等一些重要活性功能。在食品方向上,北五味子可作为优质食物供我们食用,除作为日常可食用食品外,在医学方向上,北五味子还有药用价值,这两方面的效力已成为近年来研究的热点。人们在生产加工北五味子产品的过程中,其大量叶子常作为废弃物而浪费掉,若将其合理利用,既可以降低生产成本,实现资源的有效利用,又可以减少污染,节约能耗。我们前期研究结果表明北五味子叶中含有五味子乙素,初步探索到其具有抑制乳腺癌增殖作用,进而继续研究其对紫杉醇抑制乳腺癌的增效减毒作用机制,柑橘皮中总黄酮也具有增加癌细胞敏感性,增强紫杉醇联合抗癌作用,故本论文进一步以抗氧化性为指标开发北五味子叶乙素和柑橘皮总黄酮复合物,但在实验中我们发现柑橘皮总黄酮的稳定性不佳,故我们将提取获得的柑橘皮总黄酮进行稳定性优化。本论文拟以北五味子叶为原料进行提取、分离和纯化其中的五味子乙素且定性定量分析,对其联合紫杉醇抗乳腺癌机制进行研究,为抗癌研究开发新资源。北五味子叶五味子乙素和柑橘皮总黄酮复配之前,先对柑橘皮总黄酮进行提取工艺优化及稳定性研究,保证复配物成分精确及稳定,为开发新的复配产品提供科学依据和实验基础。具体研究内容和结果如下:本文以北五味子叶为原料,通过超声波提取北五味子叶中的五味子乙素粗提液,硅胶柱层析纯化、高效液相鉴定其含量及纯度,单因素试验及响应面优化提取工艺,并进一步探讨了北五味子叶五味子乙素抗癌的生物活性作用,探究了其对紫杉醇治疗乳腺癌的减毒增效机制。在小鼠体内体外实验中建立乳腺癌小鼠模型,将其随机分为空白组、阴性组、阳性组（紫杉醇组,PTX组）、五味子乙素组（SchB组）和紫杉醇与五味子乙素联合组。ELISA法检测白细胞介素10（IL-10）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量,超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量,HE染色检测乳腺癌细胞及其周围肌肉组织的形态学状态,免疫组化检测蛋白激酶（p38）蛋白的表达,Western blot检测血管内皮生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）蛋白的表达。探究柑橘皮总黄酮的提取率及稳定性,比较超声和微波这两种工艺对柑橘皮总黄酮提取率的影响。进行复配物设计,将北五味子叶五味子乙素和柑橘皮总黄酮进行复配,探究其抗氧化的生物活性。优化北五味子叶提取五味子乙素的最佳工艺条件为:按液料比V:m（mL/g）20:1,提取试剂75%乙醇,超声功率400W,60℃提取30min。硅胶柱层析纯化得北五味子叶五味子乙素,高效液相法测其含量为3.056mg/g,纯度:98.26%。小鼠体内体外实验中,与空白组相比,PTX组、SchB组和联合组小鼠的生存时间均明显延长,肺转移灶数目明显减少（P<0.05）,联合组的变化显著大于PTX组（P<0.05）,阴性组与空白组无显著性差异（P>0.05）,与空白组相比,PTX组小鼠实体瘤重量明显降低（P<0.05）,而阴性组和SchB组差异无显著性（P>0.05）;与PTX组相比,联合组实体瘤重量明显降低（P<0.05）。与空白组相比,给予PTX作用后可引起乳腺癌小鼠血清中TNF-α和MDA含量显著升高,而IL-10、SOD、GSH含量和肿瘤组织中p38、VEGF和MMP-2蛋白的表达显著降低（P<0.05）,梭形癌细胞数量下降,周围肌肉组织被入侵程度降低;与空白组相比,给予SchB作用后,可使乳腺癌小鼠血清中TNF-α、IL-10、MDA含量和p38、VEGF和MMP-2蛋白表达明显降低,SOD和GSH含量明显升高（P<0.05）,梭形癌细胞也数量下降,肌肉组织被入侵程度也降低;PTX与SchB联合作用后,血清中TNF-α、IL-10、MDA含量和p38、VEGF和MMP-2蛋白表达显著降低,SOD和GSH含量显著升高,与PTX组相比,差异显著（P<0.05）,梭形癌细胞数量下降明显,肌肉组织被入侵程度明显降低,与空白组比,阴性组无显著性差异（P>0.05）。单因素试验和响应面优化确定了超声波法和微波萃取法提取柑橘皮总黄酮的最佳工艺条件,超声波辅助提取最佳工艺条件:乙醇浓度80%,液料比V:m（mL/g）40:1,超声时间35min,提取温度50℃,柑橘皮总黄酮提取率为13.785%±0.03%;微波萃取最佳工艺条件:乙醇浓度70%,液料比V:m（mL/g）40:1,辐照时间8min,微波功率400W,柑橘皮总黄酮提取率为13.154%±0.36%。以柑橘皮总黄酮保存率为指标,探讨了温度pH等一系列指标对柑橘皮总黄酮稳定性的影响,结果表明总黄酮在60℃以下较稳定,pH为5.0-8.0时较稳定,氧化剂H2O2、还原剂Na2SO3、糖类和自然光影响其稳定性,柠檬酸和NaCl几乎没影响,维生素C对黄酮保存起到了促进作用。单因素试验和响应面优化复配物复配最优工艺条件:复配比(m乙素:m黄酮)为3:1,40%乙醇,复配pH8.0,清除率平均值为92.063%,与预测值（92.276%接近）。对·OH清除作用情况为复配物溶液>五味子乙素溶液>抗坏血酸溶液>总黄酮溶液,对O2-.清除作用情况为复配物溶液>抗坏血酸溶液>五味子乙素溶液>总黄酮溶液。