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研究背景创伤修复过程中成纤维细胞过度增殖,大量分泌细胞外基质(ECM),以及ECM合成与降解失衡等促进了增生性瘢痕的形成。转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1,TGF-β1)在这一病理过程中起着重要作用。TGF-β1主要通过细胞内Smads蛋白传递信号,其信号转导过程在不同层面上受到多种多样精确的调控。其中,抑制性Smad蛋白Smad7是TGF-β1/Smad信号通路的主要负向调节因子之一。泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin Proteasome Pathway,UPP)是真核细胞中蛋白质选择性降解的重要途径,广泛参与如细胞周期、DNA修复、信号转导、转录调节、吞噬等生理过程,其功能的异常与多种疾病相关。泛素-蛋白酶体途径包括泛素蛋白,泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3及26S蛋白酶体。其中,E3泛素连接酶特异性地识别靶蛋白底物,进而引发蛋白酶体降解蛋白质,在蛋白质泛素化降解的过程中起着极其重要的作用。在TGF-β1/Smad信号传导通路中,E3泛素连接酶通过选择性介导其关键组分如Smads蛋白、TGF-β受体等的泛素化降解,在TGF-β1/Smad信号活性的调节中起枢纽作用,一旦功能失调,会导致异常的TGF-β1/Smad信号传导,并引起一系列疾病的病理生理学改变。Smurf2(Smad ubiquitination regulatory factor2,Smad泛素化调节因子2)是E3泛素连接酶的一种,含HECT结构域。最近研究报道,Smurf2在多种纤维化疾病中表达异常,通过泛素化降解Smad7、核转录抑制因子SnoN(Ski-related novel gene N)、Ski(Sloan-KetteringInstitute proto-oncogene)等影响了TGF-β1信号传导通路,参与了纤维化疾病的发生、发展。最近,我们的研究显示:增生性瘢痕组织中Smurf2的表达增强,使用siRNA成功抑制增生性瘢痕成纤维细胞Smurf2的表达后,瘢痕成纤维细胞自分泌TGF-β1减少、I型胶原的合成减少、a-SMA的表达减少,提示Smurf2表达增强与增生性瘢痕的发生、发展有关。但是,在增生性瘢痕中,Smurf2是通过作用于哪一种信号分子来调节TGF-β1信号转导,尚不清楚。本研究探索E3泛素连接酶Smurf2是否通过降解TGF-β1/Smad信号通路的负向调节蛋白Smad7,从而增强TGF-β1信号的转导,参与了增生性瘢痕的形成。目的探讨Smurf2对增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β1/Smad信号转导通路负向调节因子Smad7的影响及调控机制。方法(1)以增生性瘢痕成纤维细胞为研究对象,同一个体正常皮肤成纤维细胞作为对照,采用Western Blot检测两组细胞中Smad7的蛋白表达水平;(2)加入外源性TGF-β1(10ng/ml)作用5min、15min、30min、1h、2h、12h后,采用RT-PCR和Western Blot分别检测增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞中Smad7的mRNA和蛋白表达水平;(3)收集增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞的细胞裂解液,分别加入泛素化混合物于37℃孵育1h、2h、6h,采用Western Blot检测两组细胞中Smad7的体外降解水平;(4)收集增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞的细胞裂解液,同时加入泛素化混合物及蛋白酶体抑制剂MG132/MG115(50μM/50μM),研究其对Smad7体外降解的抑制作用;(5)利用免疫共沉淀技术,研究增生性瘢痕成纤维细胞中Smad7与E3泛素连接酶Smurf2是否存在相互作用;(6)采用siRNA干扰技术沉默增生性瘢痕成纤维细胞中Smurf2的基因表达,研究沉默Smurf2后,增生性瘢痕成纤维细胞中Smad7蛋白在TGF-β1刺激下的表达水平。结果(1)在正常皮肤及增生性瘢痕成纤维细胞中,Smad7的蛋白表达水平无明显差异;(2)在外源性TGF-β1刺激下,正常皮肤成纤维细胞中Smad7mRNA和蛋白表达水平均呈时间依赖性增高,增生性瘢痕成纤维细胞中Smad7mRNA表达呈时间依赖性增加,蛋白水平无明显变化;(3)正常皮肤成纤维细胞中,Smad7的体外降解无明显变化,增生性瘢痕成纤维细胞中,Smad7的体外降解增强;(4)蛋白酶体抑制剂MG132/MG115可以阻断增生性瘢痕成纤维细胞中Smad7的体外降解;(5)在用Smurf2抗体免疫共沉淀下来的蛋白复合物中检测到Smad7,表明增生性瘢痕成纤维细胞中Smurf2与Smad7存在相互作用;(6)增生性瘢痕成纤维细胞中,加入TGF-β1刺激,Smad7的蛋白表达水平无明显变化;沉默Smurf2基因后,Smad7蛋白在TGF-β1刺激下表达增高。结论在增生性瘢痕成纤维细胞中,Smurf2可能通过泛素化降解Smad7,削弱了Smad7对TGF-β1信号转导的抑制作用,从而增强了TGF-β1/Smad信号转导,促进了增生性瘢痕的形成。