随着细胞生物学、分子生物学等生命学科的飞速发展和应用，近年来干细胞(stemcell)的研究取得了重大进展，已经成为生命科学领域研究的热点之一。一般认为，干细胞是指具有自我更新(self-renewal)能力和向多种细胞分化(multilineage-differentiation)能力的细胞。根据其发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。毛囊是皮肤的重要附属器官，具有周期性生长的特点。目前研究发现毛囊的隆突区(Bulge)是毛囊干细胞的主要栖息地，而且毛囊隆突细胞具有多向分化的能力，它不仅能够分化形成毛囊，还能够形成皮脂腺和表皮角朊细胞。尽管毛囊干细胞的研究取得了一定的进展，但是对其体外的分离、培养报道不多，这不仅限制了对它的生物学特性的研究，同时也制约了对其分化能力和调控机制的研究。我们采用显微分离与消化法结合分离出毛囊隆突区细胞，并采用不同的培养方法培养，得到具有高增殖潜能和低分化特征的毛囊干细胞，经干细胞特异性标志物的检测呈阳性表达。 角膜上皮的完整对维持角膜正常的生理功能至关重要，多种致病因素可造成角膜上皮的缺损、糜烂、溃疡，新生血管长入，结果导致假性胬肉形成，角膜缘缺失，解决这些问题就要求重建角膜上皮。角膜缘干细胞是角膜再生的来源，但是在许多病理情况下，角膜上皮的缺损已经大大超出了机体自身角膜缘干细胞的补充能力，而同种异体角膜缘干细胞移植经常出现免疫排斥。为此，我们试图寻找新的角膜上皮的再生来源。 目前的研究证明，成体干细胞具有多向分化能力，干细胞所处的微环境决定了其分化方向。角膜基质是角膜缘干细胞的微环境，具有维持角膜缘干细胞特性的作用。实验发现，角膜基质中的角膜基质细胞细胞分泌的细胞因子有利于角膜缘干细胞的增殖，并且角膜基质细胞可以调节角膜上皮的功能。研究发现一定的条件下，角膜上皮基底细胞可以分化为表皮细胞。本实验以大鼠角膜基质作为诱导环境，在transwell培养体系中，将毛囊Bulge细胞与角膜基质细胞进行共培养，经过定向诱导分化后，观察角膜上皮特异的标志物K12的表达情况。主要结果如下： 1、毛囊干细胞的培养及鉴定 采用免疫组化技术，检测大鼠毛囊Bulge区细胞干细胞表面标志物和分化标志物的表达情况，运用显微分离及酶消化法分离并培养大鼠毛囊Bulge细胞，观察培养的毛囊干细胞体外生长特性。结果发现：(1)干细胞表面标志物K19、β1整联蛋白的表达主要位于毛囊的Bulge区，而该区不表达毛囊上皮的细胞分化标志K10。(2)经显微分离及酶消化后的毛囊Bulge细胞活力好，纯度高，24h即可贴壁呈克隆生长，在培养6～7天细胞数量达峰值，以后细胞生长减慢，传代后细胞成克隆生长，生长良好，细胞形态均一，呈铺路石状，核浆比例大，表现出原始细胞形态的特征，传至4代以后，细胞生长能力减弱。(3)免疫细胞化学检测，群集生长的毛囊Bulge细胞表达K19和β1整合素，运用免疫荧光双标方法检测细胞α6-integrin和CD71的表达，该干细胞强表达α6-integrin,而CD71表达较弱。传代后及随着培养时间的延长，细胞的K19和β1整合素阳性表达逐渐减弱，阳性细胞逐渐减少。 2、建立角膜基质等同物模型 显微分离并培养角膜缘基质细胞，然后将角膜缘基质细胞培养于胶原中，模拟在体角膜基质。结果发现：(1)体外生长的角膜缘基质细胞类成纤维细胞样，呈梭形或不规则三角形，细胞核为椭圆形位于中央，细胞呈旋涡状排列生长。培养7天后，细胞出现融合状态。(2)角膜基质等同物中基质细胞分布于各层，生长良好，切片观察与在体角膜结构类似。 3、毛囊干细胞的体外诱导分化 我们分别采用两种不同的诱导体系：(1)在transwell培养体系中，将毛囊Bulge细胞与角膜基质细胞置于不同平面共培养。(2)将毛囊干细胞接种于角膜基质等同物上，观察毛囊干细胞的生长和分化情况。结果发现：(1)在transwell共培养5天后，毛囊Bulge细胞开始出现分化，细胞形态逐渐增大，细胞间隙减小，两周后免疫组化检测细胞表达角膜上皮细胞特异性标志K12，说明毛囊干细胞具有向角膜上皮细胞分化的潜能。(2)毛囊Bulge细胞接种到三维凝胶上易于贴壁，细胞呈克隆性生长。随着时间延长，细胞逐渐分化分层连接成片状，细胞形态与角膜上皮相似。 本实验首先在体外分离培养毛囊bulge区细胞，并通过观察细胞的体外生长特性和标记物鉴定，获得稳定生长的毛囊干细胞。首次成功地将毛囊干细胞在体外定向诱导，向角膜上皮细胞分化，为组织工程化角膜的研究开辟了新的方向，也为成体干细胞转分化能力的研究提供了直接的实验依据。毛囊干细胞接种到凝胶上易于贴壁，细胞呈克隆生长，随着培养时间的延长逐渐分化分层，部分细胞出现拉网现象，光镜下观察与体外培养的角膜上皮细胞形态相似。