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第一部分15例Dent病患儿临床特征分析及枸橼酸钾联合氢氯噻嗪及ACEI类药物治疗的长期临床观察目的:总结我院随访的15例Dent病患儿的临床特征,并分析其与基因型之间的相关性;探讨给予枸橼酸钾联合氢氯噻嗪及肾素血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)治疗的患儿的药物疗效,为Dent病的药物治疗提供临床经验。方法:选取2006年7月至2014年3月诊断为Dent病的患儿。根据尿蛋白、尿钙及血钾水平,给予枸橼酸钾联合氢氯噻嗪及ACEI类药物治疗。比较分析其治疗前后各项指标的变化。主要观察指标包括:尿蛋白、尿钙、肾功能、血清肌酶、肾脏超声、骨密度等。结果:1.共有15例男性患儿纳入研究,发病年龄3月~11岁,平均(2.62±3.11)岁,病程0.5年~9.5年,平均(2.81±2.34)年,均存在低分子蛋白尿(LWMP)及高钙尿,3例存在血尿。治疗前15例中:4例肌酶升高;10例患儿行肾活检,结果为:轻微病变7例,局灶性球性肾小球硬化(FGGS)1例,轻度系膜增生性Ig A肾病1例,系膜增生性Ig M肾病伴肾小管间质损伤1例;5例存在肾脏钙化灶,1例存在肾脏结石;3例存在身材矮小;5例存在骨质疏松;10例患儿行基因检测,6例CLCN5突变,1例OCRL1突变,3例未发现基因突变。2.对15例患儿进行了0.5~7.5年的随访,平均随访时间为(3.61±2.26)年。至随访结束时,15例患儿给予枸橼酸钾治疗,平均剂量(0.16±0.12)g/kg·d;11例患儿联合氢氯噻嗪治疗,平均剂量(0.75±0.41)mg/kg·d,另4例因随访期间尿钙控制可而逐渐停用氢氯噻嗪;13例患儿联合贝那普利治疗,平均(0.17±0.06)mg/kg·d,2例患儿因随访期间出现低血压(血压<80/50mm Hg)而停用药物。3.治疗效果:治疗前后,尿钙/肌酐差异有显著统计学意义(0.41±0.19mg/mg VS 0.26±0.12mg/mg,P=0.021),24小时尿钙定量的差异有显著统计学意义(6.76±2.0mg/kg Vs 4.34±1.97 mg/kg,P=0.000)。24小时尿蛋白定量的差异无显著统计学意义(0.96±0.62g/24h VS 0.87±0.44g/24h,P=0.327)。治疗前后,尿蛋白比例均以小分子蛋白为主。治疗后:原有3例血尿患儿仍存在血尿,未见加重;3例存在肌酶升高,1例恢复正常;2例重复肾活检,结果分别为轻微病变及局灶性肾小球肾炎伴肾小管间质损伤;肾脏超声示:原有1例肾结石患儿超声显示结石消失,5例存在肾脏钙化灶患儿治疗后肾脏钙化灶消失;4例存在骨质疏松,1例治愈;原有3例存在身材矮小者,1例生长激素治疗后身高追至第10百分位线,其余2例仍存在身材矮小,另有1例于随访1.25年后诊断为身材矮小。治疗前后,患儿血肌酐及肾小球滤过率(GFR)均正常。4.15例患儿中4例口服氢氯噻嗪后出现低钾血症,2例口服贝那普利后出现低血压。结论:1.本组合并大量蛋白尿的Dent病患儿,肾活检未见局灶节段性肾小球硬化(FSGS)。2.6例CLCN5基因突变者临床表型及基因型未发现明显相关性。3.确诊为Dent病的患儿,给予枸橼酸钾联合氢氯噻嗪及ACEI类药物治疗可明显降低尿钙排泄水平,长期治疗可使肾脏结石及钙化灶消失。4.本随访中给予的贝那普利在降尿蛋白水平上作用不明显,且低分子蛋白尿无明显改善。5.给予氢氯噻嗪类药物及ACEI类药物治疗时,需严密监测血钾及血压水平,如出现低钾血症和低血压时应及时给予处理。第二部分CLCN5基因及2个突变体表达载体系统的构建目的:我们发现2个新的基因突变,L594fs X595和IVS4-2A>G,目前尚无文献报道。为探索其突变后的功能变化,我们设计通过全基因合成技术,构建1个野生型和2个突变型电压门控性氯离子通道蛋白5基因(CLCN5)真核表达载体系统,为研究Dent病的发病机制提供实验基础。方法:首先通过全基因合成技术将正常CLCN5基因和2个CLCN5基因突变体的基因序列从细胞文库中扩增,在证实3个基因序列正确后,用限制性内切酶Bam HⅠ,Eco RⅠ将目的基因片段酶切后与真核表达载体pc DNA3.1(+)/EGFP/IRES连接,转化至感受态细胞,最后成功构建pc DNA3.1(+)/EGFP/IRES-CLCN5、pc DNA3.1(+)/EGFP/IRES-c.2073del GCLCN5及pc DNA3.1(+)/EGFP/IRES-IVS4-2A>GCLCN5共3个真核表达载体系统。结果:构建的突变体经DNA直接测序显示存在CLCN5基因L594fs X595剪切突变和IVS4-2A>G无义突变。提取转化后培养阳性菌落中的质粒,将DNA溶液送检基因测序,测序结果显示基因序列比对正确,载体构建成功。结论:pc DNA3.1(+)/EGFP/IRES-CLCN5、pc DNA3.1(+)/EGFP/IRES-c.2073del G CLCN5及pc DNA3.1(+)/EGFP/IRES-IVS4-2A>GCLCN5共3个真核表达载体系统的构建,为进一步研究该突变体的功能和结构,探索尿蛋白重吸收的分子机理提供实验基础。