适度超声辅助酶解制备微拟球藻抗氧化肽

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提油后的微拟球藻(藻渣)仍含有大量的蛋白质、粗纤维等成分,其中蛋白质含量占50%左右。因为缺乏利用途径,一般作为工业废料被丢弃,这不仅造成了环境的污染,也是对蛋白质资源的严重浪费。为此,本研究以脱脂微拟球藻为原料制备微拟球藻抗氧化肽。为避免长时间的超声处理造成蛋白酶活力的降低和多肽的聚集等问题,用适度超声辅助酶解(MUE)代替传统的全程超声辅助酶解(WUE)和超声预处理酶解(UPE),即采用适当时间的超声打开蛋白质大分子的结构和提高蛋白酶的活力,然后以常规酶解法(CE)进行后续的酶解过程。以微拟球藻蛋白酶解产物(NPHs)的DPPH和OH自由基清除率为指标,采用单因素和响应面试验优化微拟球藻抗氧化肽的制备条件。比较了MUE、CE、UPE和WUE四种方法制备的NPHs(分别记为MUH、对照组、UPH和WUH)的抗氧化活性,测定其分子量分布与氨基酸组成,同时对其结构进行测定分析,探究适度超声影响其抗氧化活性的作用机理;测定MUH分离组分的抗氧化活性,及对H2O2介导的L929细胞氧化损伤的保护作用,为天然微拟球藻抗氧化肽的应用开发提供一定的基础数据。主要结论如下:(1)优化了微拟球藻蛋白酶解条件。得到MUE的最佳酶解条件:超声功率密度0.7 W/m L、超声时间21 min、底物浓度40 g/L、加酶量7000 U/g、总酶解时间(超声+常规)60 min。在此条件下,NPHs的DPPH和OH自由基清除率分别为75.33%±0.21%和58.08%±0.26%,DPPH和OH自由基清除率比常规制备方法(CE)分别提高了15.18%和7.29%。同时得到MUE制备NPHs的得率为64.51%,较常规酶解提高了16.57%。(2)研究了适度超声对NPHs抗氧化活性的影响并对其表征。适度超声显著提高了NPHs的抗氧化活性,改变了酶解产物的分子量分布和氨基酸组成结果。MUH的红外和紫外光谱的变化表明适度超声在酶解过程中改变了蛋白的结构并导致MUH的结构也有所改变;MUH巯基含量增加,表面疏水性增加,二硫键含量有所减少,表明了适度超声能够使得蛋白质内部的疏水基团及区域暴露出来,酶解过程中产生更多的疏水性氨基酸末端的肽段;zeta电位的绝对值变大,表明MUH更加稳定且供电子能力增强;同时扫描电镜和原子力显微镜的结果表明MUH的结构更加疏松,表面粗糙度有所增加。因此,MUH较UPH、WUH和对照组抗氧化活性更高。(3)研究了MUH组分的抗氧化活性及其对H2O2介导的L929细胞氧化损伤的保护作用。MUH-1(<3k Da)显示出最高的抗氧化活性。MUH及其分离组分可以通过降低细胞内丙二醛(MDA)含量和抑制超氧化物歧化酶(SOD)活性的衰减来缓解细胞的氧化损伤,并且MUH-1对L929细胞氧化损伤的保护作用较其他样品组最好,略低于0.5 mg/m L谷胱甘肽(GSH)的效果。
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