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阿片成瘾是一种复杂的、复发性的脑病,主要表现为强迫性的觅药行为、无法控制的用药,以及戒断后负性情绪状态的产生。成瘾者在长期戒断后,当再次使用药物、遭遇应激事件或接触药物滥用的相关环境时,依然会表现为冲动控制能力的下降、冲动行为增加,并引发复吸。长期药物滥用导致的奖赏和记忆神经环路的异常重构被认为是成瘾行为形成的关键。然而,对成瘾行为形成中突触及结构的可塑性变化尚需进一步阐明。本实验从骨架肌动蛋白入手,结合动物行为学、分子细胞生物学等方法,研究大鼠吗啡戒断和复吸形成过程中肌动蛋白重构的变化及机制,进一步深化对阿片类药物成瘾的分子生物学机制的认识。第一部分吗啡戒断及再诱导大鼠不同脑区肌动蛋白重构及其机制研究目的:研究大鼠吗啡戒断及再诱导后不同脑区肌动蛋白的变化方法:1吗啡依赖、戒断和吗啡再诱导大鼠模型的制备:清洁级雄性SD大鼠48只,按随机分组原则分组。N2、N4、N5和N6组采用剂量递增法腹腔注射盐酸吗啡7天,以建立吗啡依赖模型,N1组及N3组给予等体积的生理盐水。第8-20d,停止注射。第21d,N3组和N4动物,腹腔注射10mg/kg吗啡;N6组和N5组,先分别右侧脑室注射1μL的生理盐水和0.5μg/μL Latrunculin A,10min后,再腹腔注射10mg/kg吗啡;N1组腹腔注射等体积生理盐水;N2组不做处理。1.1行为学评分:第8-21d,每天观察20min行为学变化,包括:湿狗样颤抖、站立、伸展、清理皮毛、吞咽、齿颤、舔阴、腹泻。第21d,所有组进行行为学评分。所有组动物,在所有测试完成后,立马戊巴比妥钠麻醉,断头取脑,分离相关脑区:海马(Hip),前额叶皮质(Pfc),纹状体(Str),伏隔核(NAc)。2 Western-blot检测脑组织中各种蛋白的表达水平:成瘾相关脑区组织匀浆提取总蛋白,测定其中相关蛋白变化。肌动蛋白分为两种形式:胞浆可溶性蛋白(G-actin)和细胞骨架相关蛋白(F-actin)。采用不同缓冲液对这两种蛋白进行分步提取,分别观察肌动蛋白(G-actin和F-actin)及其结合蛋白(cofilin,drebrin A/E,cortactin,WAVE-2,N-WASP,Calcinerurin A,Profilin-1,ARP2,ARP3,SSH1以及β-actin)表达变化。结果:1不同脑区在电镜下的形态学变化:对照组海马CA1区、前额叶皮质和伏隔核中,突触前可见线粒体,有大量突触小泡,与突触前膜相比,突触后膜均匀增厚;啡依赖组各脑区,可见突触后膜明显增厚;自然戒断组,突触后膜仍明显增厚。2行为学症状评分:吗啡戒断14后,恢复正常;再次用吗啡诱导,行为学评分又显著升高45%(P<0.001)。Latrunculin A阻断吗啡再诱导后,行为学评分无显著性变化。3 Western-blot检测脑组织中各种蛋白的表达水平3.1 W组与NS/NS组相比:海马中,总cortactin上调66%(P<0.01);ARP2上调35%(P<0.05)。前额叶皮质中,profilin-1下调27%(P<0.01)。纹状体中,N-WASP下调20%(P<0.05)。伏隔核中,P-cofilin/cofilin的比例下调20%(P<0.01);WAVE-2下调45%(P<0.01)。3.2 M/M组与W组相比:海马中,F-actin/G-actin比例下调13%(P<0.05);Drebrin A/E与F-actin和G-actin的结合游离比,下调12%(P<0.05);cortactin与F-actin和G-actin的结合游离比,上调30%(P<0.05);SSH1上调40%(P<0.05);P-cofilin/cofilin比例下调36%(P<0.05);N-WASP,上调42%(P<0.05);calcinurin A,上调13%(P<0.05)。前额叶皮质中,总drenbrin A/E,上调58%(P<0.05);P-cofilin/cofilin比例,下调13%(P<0.05);calcinurin A上调50%(P<0.05)。纹状体中,总drenbrin A/E,上调45%(P<0.05)。伏隔核中,calcinurin A,上调13%(P<0.05)。3.3 M/Lat-A/M与M/M组相比:海马中,Drebrin与F-actin和G-actin的结合游离比,下调20%(P<0.05);SSH1,下调64%(P<0.01);ARP2,下调45%(P<0.05);P-cofilin/cofilin比例,上调60%(P<0.05);WAVE-2,下调21%(P<0.01)。前额叶皮质中,总drenbrin A/E,下调89%(P<0.01);N-WASP,上调45%(P<0.05);WAVE-2,下调21%(P<0.01)。纹状体中,总drenbrin A/E,下调56%(P<0.01);总cortactin,上调28%(P<0.05);N-WASP,上调39%(P<0.05)。伏隔核中,总cortactin,上调84%(P<0.05);N-WASP,上调38%(P<0.001);WAVE-2,上调29%(P<0.01);calcinurin A,上调20%(P<0.05)。结论:长期吗啡处理可导致成瘾相关脑区突触发生可塑性变化,表现为突触后膜明显增厚,并且在戒断症状消失后仍然存在。戒断完成后再给吗啡诱导,可以使行为学发生变化,伴随肌动蛋白重构,并呈现脑区特异性。海马中,肌动蛋白的重构可能与促进蛋白核化和解聚过程有关。第二部分吗啡诱导条件位置偏爱复燃大鼠海马肌动蛋白重构及其机制研究目的:研究吗啡诱导条件位置偏爱复燃大鼠海马肌动蛋白的变化方法:1吗啡诱导CPP复燃模型制备:清洁级雄性SD大鼠32只,按随机分组原则分组,分为N1:NS/NS组,N2:M/NS/M组,N3:M/Lat-A/M组,N4:M/FK-506/M组,每组8只。适应期:1-3天,每天对所有组动物进行CPP监测,每次15min,确定动物的偏爱环境。训练期:4-11天,N2、N3及N4组动物,每天上午腹腔注射吗啡10mg/kg,放入伴药箱中,训练40 min;下午注射等体积生理盐水,放入非伴药箱中,训练40min。N1组,注射等体积生理盐水,进行相同训练。测试期:第12天,所有组动物均进行CPP监测。戒断期:每5天测试一次,约需15天戒断完成。再诱导期:N1组动物,腹腔注射等体积生理盐水;N2、N3及N4组动物,双侧海马各给以1μL溶剂、0.5μg/μL Latrunculin A及5.0μg/μL FK-506,30min后,腹腔注射10mg/kg吗啡。所有组动物腹腔注射药物15min后,进行CPP测试。所有组动物,在所有测试完成后,立马戊巴比妥钠麻醉,断头取脑,分离相关脑区:海马(Hip)和伏隔核(NAc)。2 Western-blot检测脑组织中各种蛋白的表达水平成瘾相关脑区组织匀浆提取总蛋白,测定其中相关蛋白变化。采用不同缓冲液对这两种蛋白进行分步提取,分别观察海马中肌动蛋白(G-actin和F-actin)及其结合蛋白(cofilin,P-cofilin,drebrin A/E,cortactin,N-WASP,Calcinerurin A,Glutamate Receptor 1,P-Glutamate Receptor 1以及β-actin)表达变化。结果:1吗啡诱导CPP行为评分:在CPP实验训练完成24h后,吗啡组CPP评分与对照组相比,上升400%(p<0.05);待大鼠CPP行为完全消退后,再次吗啡诱导,CPP评分上升1200%(P<0.01);与吗啡诱导组相比,脑室给Latrunculin A和FK-506组CPP评分分别下调1204%(P<0.001)、1260%(P<0.001)。2吗啡诱导CPP复燃大鼠海马和伏隔核蛋白表达变化2.1 M/NS/M组与NS/NS组相比:海马中,F-actin/G-actin比例,下调50%(P<0.05);Drebrin A/E与F-actin和G-actin的结合游离比,下调10%(P<0.05);cortactin与F-actin和G-actin的结合游离比,下调35%(P<0.05);P-Glu R1/Glu R1比例,上调45%(P<0.05);Calcineurin A,上调15%(P<0.05)。伏隔核中,P-Glu R1/Glu R1比例,上调20%(P<0.05)。2.2 M/Lat-A/M组与M/NS/M组相比:海马中,F-actin/G-actin比例,上调47%(P<0.01);cortactin与F-actin和G-actin的结合游离比,上调35%(P<0.05);P-Glu R1/Glu R1比例,下调65%(P<0.01)。伏隔核中,P-Glu R1/Glu R1比例,下调70%(P<0.01)。2.3 M/FK-506/M组与M/NS/M组相比:海马中,F-actin/G-actin比例,上调50%(P<0.05);Drebrin A/E与F-actin和G-actin的结合游离比,上调60%(P<0.05);cortactin与F-actin和G-actin的结合游离比,上调50%(P<0.05);P-Glu R1/Glu R1比例,下调60%(P<0.05);Calcineurin A,下调15%(P<0.05)。伏隔核中,P-Glu R1/Glu R1比例,下调50%(P<0.01)。结论:吗啡可诱导大鼠CPP行为消退后复燃,并伴随海马肌动蛋白重构;背侧海马给入Lantruculin A和FK506可抑制吗啡诱导的大鼠CPP行为复燃,其作用机制可能与抑制海马肌动蛋白重构,改变海马投射到伏隔核的谷氨酸能神经活性有关。