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【背景】乳腺癌是全球妇女最常见的恶性肿瘤之一，其高发病率和死亡率严重威胁着妇女的身心健康。乳腺肿瘤的侵袭和远端扩散是造成乳腺癌患者难以根治或死亡的主要原因，因此，找到并了解乳腺肿瘤发生、转移及扩散的相关因素将有可能成为治疗乳腺癌新的分子靶点。胰岛素样生长因子IImRNA结合蛋白1（insulin1ikegrowthfactormRNAbindingprotein1，IGF2BP1或IMP1）是RNA结合蛋白IGF2BP家族成员，主要在胚胎发育时期和恶变组织中表达。大量研究表明，作为保守的RNA结合蛋白家族的成员，IMP1正是通过与mRNAs直接作用并调控它们的定位、降解和翻译，因而实现抑制乳腺肿瘤生长和进一步转移的作用。不仅如此，IMP1对长非编RNA（lncRNA）的调控作用也已初见报道。课题组前期研究发现，IMP1具有抑制乳腺癌细胞增殖与侵袭的能力。鉴于lncRNA对细胞功能和生命活动的重要性日益显露，我们推断，作为一个多功能的RNA调控蛋白，IMP1必然参与lncRNA的代谢和调控，而这种调控必定有其重要的生物学意义。长链非编码RNAs（long-noncodingRNAs，lncRNAs）是一类广泛存在的、多样的内源性RNA，能与DNA、RNA、蛋白质相互作用，从多个方面对基因表达进行调控。现有研究表明，lncRNA通过多种机制发挥促癌或抑癌的功能。lncRNADANCR最早由yuan等在肝癌中发现，lncRNADANCR在肿瘤的发生和发展中发挥重要的作用。目前，lncRNADANCR在多种癌细胞中是促癌的，但在乳腺癌细胞中相关的生物学功能尚不清楚。
【目的】1.鉴定乳腺癌细胞中与IMP1形成复合物的lncRNAs，明确目标lncRNA的细胞学功能。2.探讨长链非编码RNA（lncRNA）DANCR在乳腺癌细胞中的表达及其对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响。
【方法】（1）构建pCIP2-MBP-IMP1重组质粒，以慢病毒为载体分别构建MDA-MB-231（MDA231）以及BT549四种人乳腺癌细胞的MBP-IMP1稳定过表达细胞株；（2）在过表达IMP1的MDA231乳腺癌细胞中，运用pulldown原理，利用MBPAmyloseBeads沉淀MBP-IMP1融合蛋白以及其潜在的结合RNA；（3）利用麦芽糖洗脱沉淀，将洗脱沉淀物送往上海伯豪生物有限公司提取总RNA并进行二代测序；（4）分析测序结果，找出两种乳腺癌细胞共有的且上调倍数2倍以上的lncRNADANCR、SNHG16作为研究对象，实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）验证RIP-Seq测序结果；（5）对MDA231-MBP-IMP1和MDA231-pCIP2乳腺癌细胞株的pulldown产物进行qRT-PCR分析，其qRT-PCR验证结果与测序结果一致。然后我们分析了IMP1过表达是否影响lncRNADANCR和SNHG16的表达。在MDA231、T47D、MCF7以及BT549四种野生型人乳腺癌细胞中利用qRT-PCR技术分析DANCR和SNHG16的表达水平，选取表达量最低的细胞系做过表达实验，表达量最高的细胞系做敲减实验。（6）构建pCIP2-DANCR重组质粒，利用MS2衣壳蛋白可以与MS2结合位点（MS2bs）特异性结合的特点，构建pCIP2-DANCR-MS2bs重组质粒，以慢病毒为载体分别构建DANCR和DANCR-MS2bs稳定过表达的MDA231细胞株，用qRT-PCR检测两种稳定过表达细胞株是否构建成功。（7）合成DANCR的小干扰RNA，在MCF7细胞中转染siRNA-DANCR并进行qRT-PCR验证其干扰效率。（8）通过MTT实验和划痕实验观察过表达DANCR对MDA231细胞增殖和迁移的影响。进行RNA干扰后观察DANCR对MCF7细胞增殖和迁移的影响。
【结果】（1）成功构建pCIP2-MBP-IMP1重组质粒和完成IMP1-RNA免疫共沉淀实验。（2）RNA-Seq的结果显示，MDA231-MBP-IMP1组表达上调的RNA有10339个，而本课题组彭佩在T47D细胞做的RNA-Seq结果中有10614个上调的RNA。其中两组细胞上调相同的RNA有3796个、上调相同的lncRNA有172个、共同上调2倍以上的lncRNA有94个，其中有27个lncRNA与IMP1有共同的保守序列。（3）qRT-PCR结果表明，与对照组MDA231-pCIP2比，过表达MDA231-MBP-IMP1组的DANCR和SNHG16表达水平均升高(P＜0.05)；在过表达MDA231-MBP-IMP1乳腺癌细胞pulldown后DANCR和SNHG16得到富集（P＜0.05），与RNA-Seq的结果相符。DANCR在四种乳腺癌细胞（MDA231，MCF7，BT549，T47D）中相对表达量为：MDA231＜BT549＜T47D＜MCF7。（4）成功构建质粒pCIP2-DANCR和pCIP2-DANCR-MS2bs。（5）成功构建DANCR和DANCR-MS2bs稳定过表达的MDA231细胞株。（6）过表达DANCR能够抑制乳腺癌细胞的增殖。然而，敲减DANCR对细胞增殖和迁移不明显。
【结论】DANCR能抑制乳腺癌细胞MDA231增殖。
【目的】1.鉴定乳腺癌细胞中与IMP1形成复合物的lncRNAs，明确目标lncRNA的细胞学功能。2.探讨长链非编码RNA（lncRNA）DANCR在乳腺癌细胞中的表达及其对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响。
【方法】（1）构建pCIP2-MBP-IMP1重组质粒，以慢病毒为载体分别构建MDA-MB-231（MDA231）以及BT549四种人乳腺癌细胞的MBP-IMP1稳定过表达细胞株；（2）在过表达IMP1的MDA231乳腺癌细胞中，运用pulldown原理，利用MBPAmyloseBeads沉淀MBP-IMP1融合蛋白以及其潜在的结合RNA；（3）利用麦芽糖洗脱沉淀，将洗脱沉淀物送往上海伯豪生物有限公司提取总RNA并进行二代测序；（4）分析测序结果，找出两种乳腺癌细胞共有的且上调倍数2倍以上的lncRNADANCR、SNHG16作为研究对象，实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）验证RIP-Seq测序结果；（5）对MDA231-MBP-IMP1和MDA231-pCIP2乳腺癌细胞株的pulldown产物进行qRT-PCR分析，其qRT-PCR验证结果与测序结果一致。然后我们分析了IMP1过表达是否影响lncRNADANCR和SNHG16的表达。在MDA231、T47D、MCF7以及BT549四种野生型人乳腺癌细胞中利用qRT-PCR技术分析DANCR和SNHG16的表达水平，选取表达量最低的细胞系做过表达实验，表达量最高的细胞系做敲减实验。（6）构建pCIP2-DANCR重组质粒，利用MS2衣壳蛋白可以与MS2结合位点（MS2bs）特异性结合的特点，构建pCIP2-DANCR-MS2bs重组质粒，以慢病毒为载体分别构建DANCR和DANCR-MS2bs稳定过表达的MDA231细胞株，用qRT-PCR检测两种稳定过表达细胞株是否构建成功。（7）合成DANCR的小干扰RNA，在MCF7细胞中转染siRNA-DANCR并进行qRT-PCR验证其干扰效率。（8）通过MTT实验和划痕实验观察过表达DANCR对MDA231细胞增殖和迁移的影响。进行RNA干扰后观察DANCR对MCF7细胞增殖和迁移的影响。
【结果】（1）成功构建pCIP2-MBP-IMP1重组质粒和完成IMP1-RNA免疫共沉淀实验。（2）RNA-Seq的结果显示，MDA231-MBP-IMP1组表达上调的RNA有10339个，而本课题组彭佩在T47D细胞做的RNA-Seq结果中有10614个上调的RNA。其中两组细胞上调相同的RNA有3796个、上调相同的lncRNA有172个、共同上调2倍以上的lncRNA有94个，其中有27个lncRNA与IMP1有共同的保守序列。（3）qRT-PCR结果表明，与对照组MDA231-pCIP2比，过表达MDA231-MBP-IMP1组的DANCR和SNHG16表达水平均升高(P＜0.05)；在过表达MDA231-MBP-IMP1乳腺癌细胞pulldown后DANCR和SNHG16得到富集（P＜0.05），与RNA-Seq的结果相符。DANCR在四种乳腺癌细胞（MDA231，MCF7，BT549，T47D）中相对表达量为：MDA231＜BT549＜T47D＜MCF7。（4）成功构建质粒pCIP2-DANCR和pCIP2-DANCR-MS2bs。（5）成功构建DANCR和DANCR-MS2bs稳定过表达的MDA231细胞株。（6）过表达DANCR能够抑制乳腺癌细胞的增殖。然而，敲减DANCR对细胞增殖和迁移不明显。
【结论】DANCR能抑制乳腺癌细胞MDA231增殖。