目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种慢性代谢性疾病,主要特征包括高血糖、胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)和胰腺β细胞分泌胰岛素障碍等。世界上的糖尿病患者人数已经超过3.47亿。其中,2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的发病率呈现逐年上升趋势,发病人数约占糖尿病患者总人数的90%。糖尿病可以导致一系列的微小血管和大血管并发症,例如:糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病神经病变、缺血性心脏病和脑血管病等。因此,研制安全、有效的糖尿病治疗药物具有十分重要的意义。其中,分子水平靶向药物具有非常好的前景。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病较为常见的微血管并发症之一,也是导致患者出现终末期肾脏疾病的首要原因。三分之一的1型和2型糖尿病患者会发生糖尿病肾病。我国2型糖尿病患者的糖尿病肾病发病率约为6.6%至18.51%,且呈明显上升趋势。但是,目前尚无治疗糖尿病肾病的有效方法。研究发现,肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTEC)损伤是比肾小球损伤更能反映肾脏功能不全的指标。肾脏近曲小管上皮细胞损伤在糖尿病肾病患者、小鼠糖尿病模型和大鼠糖尿病模型的病理切片中普遍存在,这提示肾脏近曲小管上皮细胞损伤是肾小管损伤的重要组成部分,也是衡量疾病进展情况的可靠指标。此外,血糖升高可以导致近曲小管上皮损伤,而后者随后会导致严重的肾脏功能异常。但是,近曲小管上皮细胞损伤过程中的具体机制尚未完全阐明。c-Src是Src酪氨酸激酶家族中的重要成员,在有丝分裂、细胞生长和肿瘤发生等方面发挥了重要作用。c-Src受到高糖等外界刺激后发生磷酸化并被激活,随后使许多细胞膜蛋白、胞浆蛋白和核蛋白发生磷酸化并传递细胞内信号。值得关注的是,c-Src可能与2型糖尿病患者发生糖尿病肾病密切相关。研究表明,c-Src活性在糖尿病动物肾脏以及高糖条件培养下的肾小球系膜细胞和足细胞中都明显升高。因此,c-Src已经被公认为糖尿病肾病的重要调节因子。但是,c-Src及其下游信号通路在肾小管上皮细胞损伤以及糖尿病肾病发病机制中的作用尚不明确。本研究中,我们将探讨c-src信号通路在肾脏损伤中作用。在体内,利用c-src特异性抑制剂pp2,观察c-src信号通路对肾脏功能、细胞凋亡的影响;在体外,观察c-src及其下游信号分子p38mapk、egfr在高糖培养条件下肾小管上皮细胞凋亡中的作用和分子机制。本研究将为糖尿病肾病防治提供新的作用靶点和思路,具有重要的理论意义和实用价值。方法:1c-src信号通路在db/db糖尿病小鼠肾脏损伤中的作用从南京大学模式动物研究所(modelanimalresearchcenterofnanjinguniversity)购买雄性bks背景的db/db糖尿病小鼠和db/m对照小鼠。参照美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth,nih)动物饲养指南,将小鼠饲养于无特定病原体(specific-pathogen-free,spf)级实验动物房,每日更换垫料、水和食物。经过适应性饲养后,于第8周龄开始实验。饲养过程符合河北医科大学伦理委员会的要求。将小鼠随机分组如下:(1)正常对照组(controlgroup):db/m小鼠10只,正常饲养,不进行实验药物干预;(2)糖尿病组(diabetesgroup):db/db小鼠10只,正常饲养,不进行实验药物干预;(3)糖尿病治疗组(pp2group):db/db小鼠10只,正常饲养的同时,给予c-src特异性抑制剂pp2药物干预。给药方法如下:将c-src抑制剂pp2溶于dmso,按照2mg/kg的标准,将药物经腹腔注射入小鼠体内(给药前反复吹打、混匀)。作为对照,正常对照组(controlgroup)和糖尿病组(diabetesgroup)给予腹腔注射等量生理盐水。第16周龄,将小鼠置于代谢笼中收集24h尿液。空腹6h后,称量体重,经股动脉取血后分离血清、冻存备用;处死小鼠后,固定在蜡板上,切取、称量肾脏后,取部分肾组织置于4%多聚甲醛,用于常规he染色和免疫组化检测;取部分肾组织置于2.5%戊二醛固定液,用于电镜观察;取部分肾皮质组织经液氮速冻后保存于-80℃超低温冰箱,用于westernblotting检测phospho-src、totalc-src、phospho-p38mapk、totalp38mapk、cleavedcaspase-3,bax,bcl-2和β-actin等蛋白质表达情况。2c-src/p38mapk信号通路在肾小管上皮细胞凋亡中的作用人肾小管上皮细胞hk-2(humankidney-2)购自美国模式培养物集存库(americantypeculturecollection,atcc)。用含10%胎牛血清的dmem培养液培养hk-2细胞,培养条件为5%co2、37℃。采用胰蛋白酶消化法传代。隔日更换培养液1次。待hk-2细胞达70-80%汇合后,用无血清dmem培养液同步24h。将hk-2细胞分成7组:正常糖对照组(5.6mmol/lglucose,ng)、正常糖+高渗对照组(5.6mmol/lglucose+24.5mmol/lmannitol,m)、正常糖+pp2组(5.6mmol/lglucose+2μmol/lpp2,ng+pp2)、正常糖+sb203580组(5.6mmol/lglucose+10μmol/lsb203580,ng+sb203580)、高糖组(30mmol/lglucose,hg)、高糖+pp2组(30mmol/lglucose+2μmol/lpp2,hg+pp2)和高糖+sb203580组(30mmol/lglucose+10μmol/lsb203580,hg+sb203580)。pp2和sb203580均在高糖刺激前2h开始给药。收集细胞后提取全蛋白,用于westernblotting检测phospho-src、totalc-src、phospho-p38mapk、totalp38mapk、pparγ、chop、cleavedcaspase-3、bax、bcl-2和β-actin等蛋白质表达情况。利用细胞免疫荧光技术检测hk-2细胞的c-src和p38mapk活性。此外,采用tunel技术和流式细胞术检测hk-2细胞凋亡。3c-src/egfr信号通路在肾小管上皮细胞凋亡中的作用人肾小管上皮细胞hk-2(humankidney-2)购自美国模式培养物集存库(americantypeculturecollection,atcc)。用含10%胎牛血清的dmem培养液培养hk-2细胞,培养条件为5%co2、37℃。采用胰蛋白酶消化法传代。隔日更换培养液1次。待hk-2细胞达70-80%汇合后,用无血清dmem培养液同步24h。将hk-2细胞分成4组:将细胞分成4组:对照组(5.6mmol/ld-葡萄糖,ng)、渗透压对照组(5.6mmol/ld-葡萄糖+24.5mmol/l甘露醇,m)、高糖组(30mmol/ld-葡萄糖,hg)和高糖+抑制剂组(30mmol/ld-葡萄糖+0.2mmol/lag1478,hg+ag1478)。于刺激48h后收集细胞。ag1478在高糖刺激前2h开始给药。收集细胞后提取全蛋白,用于westernblotting检测phospho-egfr、totalegfr、grp78、chop、cleavedcaspase-3、bax、bcl-2和β-actin等蛋白质表达情况。采用流式细胞术检测hk-2细胞凋亡情况。采用mtt检测hk-2细胞活性变化。结果:1c-src信号通路在db/db糖尿病小鼠肾脏损伤中的作用(1)与正常对照组(controlgroup)相比,糖尿病组(diabetesgroup)的体重、摄食量、肾重和24h尿量明显升高(p<0.05或p<0.01),但是肾重与体重比值略有降低(p<0.01)。与糖尿病组(diabetesgroup)相比,糖尿病治疗组(pp2group)的体重、摄食量略有升高(p<0.01),肾重、肾重与体重的比值以及24h尿量明显下降(p<0.05或p<0.01)。(2)与正常对照组(controlgroup)相比,糖尿病组(diabetesgroup)的血糖、血清肌酐、尿素氮、甘油三酯、低密度脂蛋白和24h尿白蛋白明显升高(p<0.01)。与糖尿病组(diabetesgroup)相比,糖尿病治疗组(pp2group)的血糖、血清肌酐、尿素氮和24h尿白蛋白均明显下降(p<0.05或p<0.01)。(3)免疫组织化学检测结果显示,正常对照组(controlgroup)中,phospho-src在肾小管和肾小球细胞胞浆中均有少量表达。糖尿病组(diabetesgroup)中,phospho-src在肾小管和肾小球细胞胞浆中的表达均有明显增加。糖尿病治疗组(pp2group)的上述表现有所减轻。(4)westernblotting检测结果显示,与正常对照组(controlgroup)相比,糖尿病组(diabetesgroup)肾组织phospho-src/totalc-src、phospho-p38mapk/totalp38mapk比值明显增加(p<0.05)。与糖尿病组(diabetesgroup)相比,糖尿病治疗组(pp2group)的phospho-src/totalc-src、phospho-p38mapk/totalp38mapk比值明显降低(p<0.05或p<0.01)。(5)westernblotting检测结果显示,与正常对照组(controlgroup)相比,糖尿病组(diabetesgroup)肾组织bax/bcl-2比值以及cleavedcaspase-3蛋白质表达明显增加(p<0.01)。与糖尿病组(diabetesgroup)相比,糖尿病治疗组(pp2group)的bax/bcl-2比值以及cleavedcaspase-3蛋白质表达明显减少(p<0.01)。2c-src/p38mapk信号通路在肾小管上皮细胞凋亡中的作用(1)与ng组相比,高糖培养(hg组)hk-2细胞导致c-src和p38mapk活性明显升高,呈时间依赖性。其中,c-src活性在高糖刺激2h开始升高,12h表达最高,24h开始下降,但是仍高于正常糖对照组(p<0.05或p<0.01);p38mapk活性在高糖刺激12h开始升高,至少持续48h以上(p<0.05或p<0.01)。(2)westernblotting检测结果显示,与ng组相比,高糖培养(hg组)hk-2细胞48h的phospho-src/totalc-src和phospho-p38mapk/totalp38mapk比值(活性)明显升高(p<0.01)。与hg组相比,pp2(hg+pp2组)能够明显降低phospho-src/totalc-src和phospho-p38mapk/totalp38mapk比值(活性)(p<0.01)。免疫荧光检测结果进一步验证了上述结果。ng组、m组和ng+pp2之间的phospho-src/totalc-src和phospho-p38mapk/totalp38mapk比值(活性)无显著差异。(3)westernblotting检测结果显示,与ng组相比,高糖培养(hg组)hk-2细胞48h的phospho-src/totalc-src比值(活性)明显升高(p<0.01)。与hg组相比,sb203580(hg+sb203580组)能够明显降低phospho-src/totalc-src比值(活性)(p<0.05)。ng组、m组和ng+sb203580之间的phospho-src/totalc-src比值(活性)无显著差异。此外,与ng组相比,高糖培养(hg组)hk-2细胞48h的pparγ、chop蛋白质表达明显升高(p<0.05或p<0.01)。与hg组相比,sb203580(hg+sb203580组)能够明显降低pparγ、chop蛋白质表达(p<0.05)。ng组、m组和ng+sb203580之间的pparγ、chop蛋白质表达无显著差异。(4)westernblotting检测结果显示,与ng组相比,高糖培养(hg组)hk-2细胞48h的bax/bcl-2比值和cleavedcaspase-3蛋白质表达明显增加(p<0.01)。与hg组相比,pp2(hg+pp2组)和sb203580(hg+sb203580组)均能够明显降低bax/bcl-2比值和cleavedcaspase-3蛋白质表达(p<0.01)。ng组、ng+pp2组和ng+sb203580组之间的bax/bcl-2比值和cleavedcaspase-3蛋白质表达无显著差异。tunel染色和流式细胞术检测进一步验证了上述结果。(5)此外,westernblotting检测结果还显示,hg+pp2组、hg+sb203580组和hg+pp2+sb203580组之间的bax/bcl-2比值和cleavedcaspase-3蛋白质表达无显著差异。3c-src/egfr信号通路在肾小管上皮细胞凋亡中的作用(1)与ng组相比,高糖培养(hg组)hk-2细胞导致egfr磷酸化水平(活性)明显升高,呈时间依赖性:高糖刺激6h开始升高,至少持续48h以上(p<0.01)。(2)与ng组相比,高糖培养(hg组)hk-2细胞48h的egfr磷酸化水平(活性)明显升高(p<0.01)。与hg组相比,pp2(hg+pp2组)能够明显降低egfr磷酸化水平(活性)(p<0.01)。ng组和m组之间的egfr磷酸化水平(活性)无显著差异。(3)与ng组相比,高糖培养(hg组)hk-2细胞48h的egfr磷酸化水平(活性)明显升高(p<0.01)。与hg组相比,ag1478(hg+ag1478组)能够明显降低egfr磷酸化水平(活性)(p<0.01)。ng组和m组之间的egfr磷酸化水平(活性)无显著差异。(4)此外,我们检测了ag1478对内质网应激指标的影响。与NG组相比,高糖培养(HG组)HK-2细胞48 h的GRP78、CHOP蛋白质表达明显升高(P<0.01)。与HG组相比,AG1478(HG+AG1478组)能够明显降低GRP78和CHOP蛋白质表达(P<0.05)。NG组和M组之间的GRP78、CHOP蛋白质表达无显著差异。(5)Western blotting检测结果显示,与NG组相比,高糖培养(HG组)HK-2细胞的Bax/Bcl-2比值和Cleaved caspase-3蛋白质表达明显增加(P<0.01)。与HG组相比,AG1478(HG+AG1478组)能够明显降低Bax/Bcl-2比值和Cleaved caspase-3蛋白质表达(P<0.05或P<0.01)。流式细胞术检测进一步验证了上述结果。(6)MTT检测结果显示,与NG组相比,高糖刺激HK-2细胞48 h后,HG组细胞活性显著降低(P<0.01)。与HG组相比,EGFR抑制剂AG1478明显改善高糖对细胞活性的抑制作用(P<0.05)。NG组和M组之间的细胞活性无显著差异。结论:1体内研究显示,c-Src特异性抑制剂PP2能够显著改善db/db糖尿病小鼠的肾脏代谢指标,保护肾脏功能。PP2不仅能够降低2型糖尿病小鼠肾脏的c-Src和p38 MAPK活性,还能够减少肾脏细胞凋亡。2体外研究显示,高糖培养HK-2细胞导致c-Src和p38 MAPK磷酸化水平(活性)明显升高,呈时间依赖性。作为p38 MAPK的上游信号分子,抑制c-Src能够降低高糖培养条件下细胞的p38 MAPK磷酸化水平(活性)。抑制p38 MAPK不仅能够降低高糖培养条件下细胞的c-Src磷酸化水平(活性),还能够减少PPARγ、CHOP蛋白质表达。抑制c-Src/p38 MAPK信号通路能够明显减少HK-2细胞凋亡。3体外研究显示,高糖培养HK-2细胞导致EGFR磷酸化水平(活性)明显升高,呈时间依赖性。作为EGFR的上游信号分子,抑制c-Src能够降低高糖培养条件下细胞的EGFR磷酸化水平(活性)。抑制EGFR能够降低高糖培养条件下细胞的GRP78、CHOP蛋白质表达。抑制c-Src/EGFR信号通路不仅能够明显减少HK-2细胞凋亡,还能改善细胞活性。