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目的：观察分子靶向药物索拉非尼与常用化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)联用模式对人肝癌细胞株MHCC97H和SMMC-7721的增殖抑制作用,并初步探讨其可能机制。方法：分别以人肝癌细胞系MHCC97H细胞和SMMC-7721细胞为靶细胞；以索拉非尼和5-FU作为细胞的干预药物；以分别单独用药、不同给药顺序的联合用药等方式干预细胞。用CCK-8方法检测药物对细胞的增殖抑制作用；参考中效原理的方法计算两药联用的联合指数(CI)；应用流式细胞技术检测药物对细胞周期的影响；采用免疫印迹法(Western Blot, WB)检测增殖相关信号通路RAF/MEK/ERK和STAT3的相关蛋白,以及细胞周期相关蛋白cyclinD1的表达。运用载有特异性发夹RNA (shRNA)的慢病毒转染技术特异性沉默MHCC97H细胞株的c-Raf基因,应用实时定量PCR (qRT-PCR)和Western Blot两种方法,分别从mRNA水平和蛋白水平检测c-Raf基因沉默的效果,观察c-Raf基因沉默后细胞增殖、细胞周期以及相关信号通路活性的变化。结果：(1)药物对肝癌细胞的半数抑制浓度(IC50)：药物对人肝癌细胞MHCC97H和SMMC-7721的IC50分别为：索拉非尼分别为(17.82±2.04)μM和(15.52+0.95)lμM；5-FU分别为(116.59±62.04)mg/L和(47.19±13.02)mg/L。两种药物对两种细胞均有明显的抑制作用,且呈浓度依赖性。(2)联合用药的给药顺序与细胞抑制作用：联合用药对两种细胞的增殖均有明显抑制作用,但抑制作用的强度与两药给药的先后顺序有关。5-FU单药组对MHCC97H和SMMC-7721细胞的抑制率分别为(33.30±5.67)%和(29.65±4.74)%。以此为对照基准,当两药同时给药时,抑制率分别为(29.87±8.83)%(p=0.328)和(30.35±4.86)%(p=0.781)；当先行5-FU预处理后再予索拉非尼,则抑制率分别为(42.57±3.29)%(p=0.017)和(53.50±1.97)%(p<0.001)；而先行索拉非尼预处理后再予5-FU,则抑制率分别为(22.98±5.93)%(p=0.023)和(23.23±4.43)%(p=0.016)。(3)联合指数(CI)评价两药的联合应用效果：参考中效原理的方法计算两药联用的联合指数(CI),当CJ>1时,提示两药产生拮抗作用；当CI<1时,提示两药产生协同作用,当CI=I时,提示两药产生叠加作用。联合用药干预MHCC97H细胞时,联合指数(CI值)分别于两药同时应用组为4.33±1.73、2.07±0.44、1.47±0.25、1.18±0.28和0.99±0.40；5-FU预处理组为3.88±1.73、5.20±2.17、3.25±2.57、1.13±0.27和0.75±0.15；索拉非尼预处理组为32.84±4.26、9.70±3.96、3.69±2.08、2.33±1.24和1.26±0.30。提示,无论何种加药顺序,CI值均大于1,即产生拮抗作用；但5-FU预处理组的CI值比索拉非尼预处理组小,而且在较高药物浓度时,其CI值已经接近甚至小于1,提示两药产生叠加甚或协同作用。联合用药干预SMMC-7721细胞时,联合指数(CI值)分别于两药同时应用组为112.45±28.23、1.95±1.01、1.33±0.38、1.45±0.33和1.02±0.09；5-FU预处理组为13.63+9.81、0.50±0.34、0.41±0.20、0.38±0.05和0.40±0.04；索拉非尼预处理组为67.40±15.67、13.50±9.43、1.80±0.11、1.66±0.17和1.71±0.06。提示,索拉非尼和5-FU同时作用、或索拉非尼预处理后再加5-FU,两药都表现为拮抗作用；而5-FU预处理后再加索拉非尼则两药产生明显协同作用。(4)联合用药的给药顺序与肝癌细胞对5-FU的敏感性：与索拉非尼(8μM)联用时,两种肝癌细胞对5-FU的敏感性随着两药加药顺序的不同而有较明显的变化。5-FU单药处理MHCC97H和SMMC-7721细胞,其IC50值分别为(116.59±62.04)mg/L和(47.19±13.02)mg/L。以此为对照基准,当索拉非尼预处理后,两种细胞对5-FU的敏感性明显降低,表现为5-FU的IC50值显著增加,分别为(477.46±146.45)mg/L和(1371.26±237.70)mg/L,P<0.001。相反,当细胞先用5-FU预处理后再加入索拉非尼时,细胞对5-FU的IC50值则明显下降,分别为(25.45±9.72)mg/L(P=0.042)和(9.47±1.03)mg/L(P=0.568)。(5)索拉非尼对细胞周期的影响：当两种肝癌细胞单用索拉非尼处理、或先用索拉非尼预处理后再加入5-FU,细胞均出现G1期阻滞,表现为G1期细胞增加,S期细胞减少。两种给药方式下,MHCC97H的G1期细胞由(47.53±0.06)%分别增加至(63.03+0.95)%和(66.70±0.30)%,P<0.001；S期细胞由(40.97±0.15)%分别下降至(17.43±0.85)%和(12.27+0.45)%,P<0.001。SMMC-7721的G1期细胞由(63.83+1.94)%分别增加至(70.07±0.70)%和(81.83±0.35)%,P<0.001；S期细胞由(27.17±2.41)%分别下降至(8.45±1.03)%和(9.23±0.12)%,P<0.001。(6)索拉非尼和/或5-FU对细胞信号通路相关蛋白表达的影响：两种肝癌细胞MHCC97H和SMMC-7721的p-c-Raf、p-ERK和p-Stat3三种蛋白的表达,与空白对照组比较,索拉非尼单用组分别为(0.47±0.10)倍、(0.47±0.05)倍、(0.38±0.05)倍和(0.47±0.12)倍、(0.54±0.03)倍、(0.51±0.02)倍,P值均<0.001；两药同时作用组分别为(0.43±0.07)倍、(0.45+0.05)倍、(0.38±0.02)倍和(0.40±0.07)倍、(0.66±0.09)倍、(0.63±0.06)倍,P值均<0.001；索拉非尼预处理组分别为(0.68±0.12)倍、(0.64±0.04)倍、(0.43±0.06)倍和(0.64±0.04)倍、(0.77±0.03)倍、(0.82±0.03)倍,P值均<0.001；5-FU预处理组分别为(0.61±0.18)倍、(0.54±0.01)倍、(0.40±0.05)倍和(0.61±0.05)倍、(0.63±0.05)倍、(0.78±0.06)倍,P值均<0.001；5-FU单用组分别为(0.95±0.065)倍、(0.96±0.04)倍、(0.96±0.03)倍和(0.93±0.06)倍、(1.06±0.12)倍、(0.95±0.06)倍,p值均>0.05。提示,索拉非尼单独、或与5-FU联用均能明显下调人肝癌细胞上述三种蛋白的表达。而5-FU单用时,三种蛋白表达的表达量无明显变化。两种肝癌细胞MHCC97H和SMMC-7721的cyclinD1蛋白表达,与空白对照组比较,索拉非尼单用组分别(0.56±0.05)倍和(0.53±0.08)倍,(P=0.002和P<0.001)；两药同时作用组分别为(0.64±0.12)倍和(0.57±0.04)倍,(p=0.008和p<0.001)；索拉非尼预处理组分别为(0.70+0.09)倍和(0.89±0.07)倍,(p=0.023和p=0.174)；5-FU预处理组分别为(0.61±0.07)倍和(0.76±0.05)倍,(p=0.004和P=0.008)。而5-FU单用时分别为(1.55±0.29)倍和(1.83±0.18)倍,(p值均<0.001)。提示,索拉非尼单用、两药联用均能明显下调两种细胞cyclin D1蛋白的表达,但后者程度较前者弱；而5-FU单用则出现相反的结果,表现为cyclin D1蛋白表达的明显增加。说明两药联用时对cyclin D1的调控以索拉非尼的作用占优势。(7) c-Raf基因沉默后肝癌细胞对5-FU敏感性的改变：野生型MHCC97H细胞对5-FU的IC50值为(116.59±62.04mg/L),与之比较,c-Raf基因沉默细胞的IC50值为(195.61±16.86)mg/L,有所升高,p=0.044；而索拉非尼预处理后的野生型细胞的IC50值为(477.46±146.45)mg/L,与c-Raf基因沉默细胞比较,明显升高,P<0.001。提示,c-Raf基因在索拉非尼引起的肝癌细胞对5-FU敏感性降低中起到关键性作用,但可能并不是唯一的作用通路。(8)肝癌细胞c-Raf基因沉默后的细胞周期变化：c-Raf基因沉默的MHCC97H细胞与野生型细胞相比,处于G1期的细胞比例明显增加,由(47.53±0.06)%增加到(57.40±0.30)%,P<0.001；S期的细胞比例明显减少,由(40.97±0.15)%减少至(20.20±0.40)%,p<0.001；与索拉非尼的作用相似。提示,索拉非尼对肝癌细胞细胞周期分布的影响可能与RAF/MEK/ERK通路相关。(9)肝癌细胞c-Raf基因沉默后的信号通路：c-Raf基因沉默的肝癌细胞,其磷酸化C-RAF、总C-RAF、磷酸化ERK蛋白的表达明显下调,分别是野生型细胞的(0.37+0.02)倍、(0.40±0.05)倍和(0.41±0.03)倍；p<0.001；其cyclin D1蛋白表达也明显下调,是野生型细胞的(0.46+0.04)倍,p<0.001；而磷酸化STAT3、总STAT3蛋白的表达没有明显变化,分别为野生型细胞的(0.99±0.08)倍和(0.99±0.05)倍,(p=0.793和p=0.659)。提示, c-Raf基因沉默能明显阻断细胞的RAF/MEK/ERK信号通路；其cyclin D1蛋白表达下调与索拉非尼的作用相一致；而c-Raf基因沉默细胞与野生型细胞的磷酸化STAT3、总STAT3蛋白的表达没有明显变化,说明,索拉非尼引起的STAT3蛋白表达下调是非RAF/MEK/ERK通路依赖的。结论：索拉非尼和5-FU单独或联用对肝癌细胞均有显著的增殖抑制作用,但两药联合应用的效果与加药顺序密切相关：5-FU是S期特异性的细胞毒药物,若5-FU在索拉非尼作用后再加入,索拉非尼可能在阻断RAF/MEK/ERK信号通路以及STAT3相关通路的双重作用下,抑制了细胞周期相关蛋白cyclin D1的表达,使肿瘤细胞阻滞在G1期,S期细胞数目减少,从而使肿瘤细胞对5-FU的敏感性降低,两药联用表现为拮抗作用,其中索拉非尼引起的STAT3蛋白表达下调是非RAF/MEK/ERK依赖的；而若5-FU作用后再加索拉非尼,则由于5-FU首先具有了充分发挥作用的机会,而索拉非尼是细胞周期非特异性药物,可继续发挥作用,两药联用表现为叠加或者协同作用。