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第一章Cx43分子在人正常视网膜及视网膜母细胞瘤(RB)组织中的表达目的:探讨细胞间隙连接蛋白(Cx)43在人类正常视网膜组织及视网膜母细胞瘤(RB)组织中的表达规律及其在RB肿瘤的发生、发展中的意义,为RB临床诊断、治疗及预后探索有效的分子指标。方法:应用免疫组织化学方法检测5例人正常视网膜组织和22例人RB组织中Cx43蛋白的表达及定位,并分别比较正常视网膜组织、RB组织及其瘤旁组织、未分化型与分化型RB组织、局限期及蔓延扩展期肿瘤组织中Cx43蛋白表达的差异。结果:1.在人类视网膜组织神经纤维层、神经节细胞层、内核层、视锥视杆细胞层、外界膜及色素上皮层中均有Cx43蛋白表达:在神经纤维层、视锥视杆细胞层、外界膜及色素上皮层中呈全层性表达,而在神经节细胞层及内核层则呈散在点、簇状表达。内界膜、内、外丛状层及外核层未见明显表达。2.免疫组织化学染色评分:①RB组织中Cx43蛋白染色评分低于正常视网膜组织,二者相比差异有显著性意义(P<0.01);②蔓延扩展期(Ⅳ~Ⅴ级)组织染色评分显著低于局限期(Ⅰ~Ⅲ级)组织(P<0.05),而每期内各级组间相比均无显著性差异(P>0.05);③分化型RB组织中,Cx43蛋白染色评分高于未分化型组织,二者相比有显著性差异(P<0.05);④在正常视网膜组织、瘤旁组织及RB肿瘤组织中染色评分依次降低,两两相比统计学上有显著性差异(P<0.05)。结论:1.人正常视网膜组织中存在Cx43蛋白的固有、广泛表达。2.人RB组织中Cx43蛋白表达显著降低,其表达水平与肿瘤的蔓延浸润及分化程度呈负相关,而与肿瘤的体积大小无关。3.Cx43蛋白表达异常可能是RB肿瘤发生、发展中的重要环节和促发因素,检测其表达可能将作为评估肿瘤预后的有意义指标。第二章全反式维甲酸对体外培养的RB细胞生长的影响目的:研究全反式维甲酸(ATRA)对体外培养的RB细胞生物学行为的影响,探索RB肿瘤药物治疗的新方法。方法:将体外培养的RB细胞随机分为5组:A组:空白对照组;B组:实验对照组(0.1%乙醇溶剂组);C组:10-5 mol/LATRA作用组;D组:10-6 mol/LATRA作用组;E组:10-7 mol/LATRA作用组。加入药物进行干预后,分别于48h、96h和144h收集各组细胞。应用MTT比色法检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞周期的变化及细胞凋亡的发生情况。结果:1.ATRA诱导RB细胞增殖减少:与对照组A、B相比,经ATRA作用后,各实验组(C、D、E组)RB细胞均表现生长速度下降,存活率降低,其存活率变化与药物浓度和作用时间呈负相关关系。2.ATRA诱导RB细胞生长周期和凋亡发生改变:与对照组相比,三实验组G0/G1期细胞比例逐渐增加而G2M、S期细胞比例相应减少,同时,细胞凋亡率也逐渐升高。G0/G1期比例和凋亡率的增加与药物浓度和作用时间呈正向变化关系。结论:1.ATRA可抑制体外培养RB细胞的生长增殖。2.ATRA通过阻滞RB细胞生长周期于G0/G1期并促进其凋亡而抑制细胞生长。在一定范围内,增加药物浓度或延长作用时间可增强此药物效应。第三章全反式维甲酸对RB细胞Cx43基因及其蛋白表达的诱导作用目的:研究ATRA对体外培养的RB细胞Cx43基因及其蛋白表达的影响,探讨ATRA抑制RB细胞生长的作用机制。方法:同前进行实验分组和药物干预,分别于药物作用后48h、96h和144h收集各组细胞。应用Western blot印迹法检测Cx43蛋白的表达变化;RT-PCR方法检测Cx43mRNA的表达及改变。结果:1.经ATRA作用后RB细胞Cx43蛋白表达增高:与对照组相比,各实验组Cx43蛋白电泳条带的光密度比率(ODR)值均增加。药物作用48h后C组、作用96h后D组以及作用144h后E组其ODR值与A组相比统计学上均有显著性差异(P<0.05)。相关性分析结果显示,ODR值的变化与药物浓度和作用时间呈正相关关系。2.经ATRA作用后RB细胞的Cx43 mRNA表达增加:与对照组相比,各实验组Cx43 mRNA电泳条带ODR值均逐渐升高。ATRA作用48h后C组以及作用96h后D、E两组ODR值与A组相比增高在统计学上均有显著性差异(P<0.05)。相关性分析结果显示,ODR值的增加与药物浓度和作用时间呈正相关关系。3.ATRA诱导RB细胞中Cx43mRNA及其蛋白表达增高与其抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡在时间上具有同步性。结论:1.通过诱导RB细胞Cx43基因表达上调从而抑制细胞增殖并促进其凋亡是ATRA的重要药理机制之一,在一定范围内,增加药物浓度或延长药物作用时间可增强此效应。2.ATRA调控Cx43基因表达的作用位点可能发生在转录水平。3.Cx43基因及其蛋白分子是RB肿瘤治疗的有效靶点。第四章裸鼠眼内RB模型的建立及全反式维甲酸对在体肿瘤的抑制作用目的:通过动物模型检验ATRA对裸鼠RB肿瘤生长的影响,为药物的临床应用提供基础性实验依据。方法:裸鼠眼前房接种体外培养的HXO-RB44细胞建立动物RB模型。将成瘤裸鼠随机分为3组:A:空白对照组,即非治疗组;B:实验对照组,即假治疗组(用0.5%无水乙醇的生理盐水行前房注射):C:治疗组,用10μg ATRA行眼前房注射。给药频率:每3d注射一次,共治疗3周。每天观察动物眼前房肿瘤形成情况及眼前节局部反应。观察结束时,摘取眼球制作石蜡切片,应用HE染色方法检测眼内肿瘤的生长情况及病理学特征。结果:1.前房接种体外培养的HXO-RB44细胞成功建立了BALB/C裸鼠眼部RB肿瘤动物模型,成瘤率为73.3%。2.动物于接种后6~9d开始成瘤。A组肿瘤生长快,于接种20d后几乎占据整个前房;观察期末(接种后25~30d),术眼眼球胀大,角膜水肿并新生血管形成。C组肿瘤生长较A组缓慢,接种后20d该组最大肿瘤体积约占前房1/3;观察期末,最大肿瘤体积<3/4前房。该组肿瘤控制率为50%。B组肿瘤体积变化与A组相比无明显差别,肿瘤控制率0%。3.组织切片病理学检查:A、B组瘤体细胞生长较紧密,前房、晶体后及玻璃体腔均可见瘤细胞生长;C组肿瘤组织相对疏松,瘤细胞分布基本局限于前房,少量见于虹膜后方,但晶体后及玻璃体腔未见瘤细胞侵犯。移植瘤组织学特点与人RB肿瘤组织相似,细胞形态光镜下观察三组间未见明显差别。结论:1.前房接种培养的HXO-RB44细胞建立BALB/C裸鼠RB模型成瘤率较高,是医学研究RB的良好模型。2.ATRA对动物在体RB移植瘤的生长具有抑制作用,可能是一种极具潜力的RB肿瘤临床治疗用药。