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重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是抗体介导的器官特异性自身免疫疾病，其特征在于抗乙酰胆碱受体(anti-acetylcholine receptor，anti-AChR)抗体与神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)的突触后膜中的乙酰胆碱受体或相关分子结合，主要临床表现为骨骼肌易疲劳和无力。
MG的体液免疫发病机制包括滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cells，Tfh)的异常增殖和生发中心(germinal center，GC)的形成。滤泡辅助型T(follicular helper Tcells，Tfh)细胞，定义为CD4+CXCR5+ICOS+T细胞，主要作用是促进和维持生发中心(germinal center，GC)的形成并促进GC中B细胞的分化，辅助B细胞产生抗体，在体液免疫中发挥了重要的调节作用。其表面的趋化因子受体CXCR5促进Tth细胞向GC的迁移。在MG患者中，胸腺增生与异位生发中心的形成相关，从而促进胸腺中B细胞产生抗AChR的抗体。
Toll样受体9(toll-like receptor9，ILR9)在免疫系统中发挥着重要的作用，能够识别存在于病毒和原核生物基因组中的未甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸，称为CpG基序，而这些二核苷酸通常在宿主DNA中甲基化。TLR9对感染的识别不仅通过诱导树突状细胞(dendritic cells，DCs)激活幼稚T细胞而且促进GC的形成以及B细胞活化和终末分化成分泌抗体的浆细胞从而调节适应性免疫。寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN)H154是TLR9信号通路的特异性抑制剂。其作用机制是通过模仿哺乳动物DNA的免疫抑制活性并干扰下游信号传导，而非通过抑制CpG的结合或摄取。在适应性免疫中，TLR9激活后可促进树突状细胞(dendritic cells，DC)激活naive T细胞、促进生发中心形成、诱导B细胞激活和分化为分泌抗体的浆细胞。在重症肌无力的相关研究中发现，MG患者外周血中TLR9的表达显著高于健康对照组，且MG患者TLR9的mRNA表达升高，与MG的临床严重程度呈正相关，高度提示TLR9可能通过促进体液免疫参与了MG的发病机制。
胸腺对抗乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AChR)抗体的产生发挥了重要的作用。多项研究发现MG患者胸腺巾自然调节性T细胞(natural regulatoUT cells，nTreg)的数量和功能存在缺陷。nTreg在胸腺中产生，移行到外周后通过多种方式发挥免疫抑制作用诱导免疫耐受，维持免疫稳态。胸腺nTreg细胞的发育受多种因素影响。其分化主要依赖于胸腺基质细胞，包括胸腺上皮细胞(thymic epithelial cells.TEC)和胸腺树突状细胞(thymic dendritic cells，tDC)。发育中的胸腺细胞在皮质内通过皮质上皮细胞(cortical thymic epithelial cells,cTEC)进行阳性选择，随后进入髓质与髓质上皮细胞(medullary thymic epithelial cells、mTEC)或tDC接触并进行阴性选择。在胸腺髓质内通过与表达MHCⅡ分子的细胞相互作用，在双阳性(double positive，DP)阶段分化为Treg细胞，在这个过程中开始表达Foxp3并分化成Foxp3+Treg细胞。
外泌体为直径30-150nm的细胞外囊泡，功能涉及T细胞，B细胞和DC等方面，与多种自身免疫疾病相关。我们课题组前期的研究发现他汀类药物可诱导耐受性DC，此耐受性DC具有调节细胞免疫和体液免疫的作用，从而缓解实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)大鼠的临床症状。之后，我们通过超离心的方法可分离他汀类药物诱导的耐受性DC所分泌的外泌体(statin-Dex)或DMSO处理的DC所分泌的外泌体(DMSO-Dex)，并且证明了statin-Dex可缓解EAMG大鼠的临床症状，这种治疗作用主要是通过上调了胸腺和外周淋巴器官中Foxp3+Treg细胞。
基于以上研究背景，本论文的目的旨在寻求重症肌无力的治疗靶点。一方面我们推测TLR9信号通路异常激活诱导的体液免疫反应增强在MG的发病机制中发挥了重要的作用，然而目前未有涉及TLR9信号通路在MG中的研究。另一方面，statin-Dex诱导EAMG免疫耐受的作用虽已证实，但其促进胸腺中nTreg分化的机制尚不明确，胸腺作为重要的中枢免疫器官，在重症肌无力的发病机制中扮演了重要角色。因此，研究内容主要从两部分人手，分别探究TLR9信号通路在MG中的调节作用及statin-Dex对胸腺Treg的诱导作用及机制。
目的：
一、通过应用TLR9信号通路的抑制剂来干扰EAMG大鼠模型，探索TLR9信号通路在EAMG体液免疫中的作用并寻求MG的治疗方法。
二、探讨statin-Dex上调EAMG大鼠胸腺内Treg细胞的机制，从而临床重症肌无力的治疗提供新的策略。
方法：
第一部分:
1.EAMG大鼠模型建立及临床评分
在雌性Lewis大鼠尾根部皮下注射200μl乳化的R-AChR97-116肽段，第30天时加强免疫一次。免疫当天记为第0天，此后每隔一天记录体重和临床评分，临床症状评估标准为:0，正常;1，活动度轻度下降，抓握力降低，声音轻微嘶哑，重复抓握后更明显;2，重复抓握前出现即出现临床症状（震颤，低头，弓背，抓握力明显减弱）;3，运动前出现严重临床症状，不能抓握，垂死状态;4，死亡。
2.ODN治疗
分别在免疫后的第5、12、19、26、30、37和44天，给予每组大鼠腹腔注射100μg对照ODN序列（5’-TCC-ATG-AGC-TTC-CTG-ATGCT-3’），或等剂量的TLR9抑制剂H154(5’-CCT-CAA-GCT-TGA-GGGG-3’)。
第二部分:
1.EAMG模型的建立及外泌体治疗
使用含有结核杆菌的完全弗氏佐剂乳化AChR97-116肽段，在大鼠尾根部皮下注射诱导EAMG模型。
雌性Lewis大鼠分成三组。一组注射PBS作为对照，另外两组分别注射DMSO或他汀类药物处理的BMDCs分泌的外泌体。分别在免疫后第5天，第10天和第15天给予外泌体治疗。免疫后第20天处死大鼠。
2.骨髓树突状细胞的培养和外泌体的分离
取6-8周龄的Lewis大鼠胫骨和股骨，冲洗骨髓腔并过滤。裂解红细胞后，重悬于含有重组大鼠(rr)GM-CSF和rrIL-4的培养基中。孵育72小时后，轻轻除去非贴壁细胞，进一步培养贴壁细胞。在第7天，收获漂浮细胞和松散粘附的细胞，加入二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)或溶于DMSO中的阿托伐他汀培养48小时后，收集上清液用于分离外泌体。
结果：
第一部分:
1.阻断TLR9信号通路缓解EAMG大鼠的临床症状
在免疫后第34天至第46天，H154组大鼠的平均临床评分低于对照ODN组的大鼠，但两组大鼠临床症状出现的时间相同（均为免疫后第34天）。在疾病高峰期，H154组大鼠的平均临床评分为0.7±0.27，对照组为1.58±0.20。两组之间的临床评分差异在免疫后第36、38、42、44和46天具有统计学意义。
2.阻断TLR9信号通路抑制EAMG大鼠体内的抗体产生
与对照组相比，H154组的火鼠体内IgG(*p＜0.05)、IgG2a(*p＜0.05)和IgG2b水平均降低(p=0.62)。此外，随着疾病的进展，EAMG大鼠血清中IgG抗体水平持续增加，尤其是强化免疫后，说明本实验中的EAMG动物模型可模拟临床疾病。
第二部分:
1.外泌体鉴定
DMSO-Dex和statin-Dex的颗粒直径主要分布在70-140nm范围内。电子显微镜下可观察到外泌体的完整形态，直径约1OOnm。通过Western方法检测TSGl01（一种成熟的外泌体标记物），可观察到两组外泌体均表达TSG101,大小为49kDa。
2.外泌体主要分布于胸腺内皮质及皮髓质交界处
外泌体主要位于胸腺内皮质以及皮质和髓质之间的交界处。DMSO-Dex组和statin-Dex组之间的分布无明显差异。此外，可观察到外泌体被角蛋白阳性的胸腺上皮细胞吞噬。
结论:
一、TLR9通路在EAMG的发病机制中发挥重要作用。应用抑制性ODN序列H154阻断TLR9通路可下调EAMG人鼠Tfh细胞和生发中心B细胞比例，从而减少抗AChR抗体产生和抗体类别转换，并最终缓解重症肌无力临床表现。
二、statin-Dex可上调胸腺内Foxp3+Treg的比例。statin-Dex和DMSO-Dex均可升高胸腺基质细胞CD40的表达，但只有statin-Dex可增加mTEC内的Aire表达。statin-Dex和DMSO-Dex在体外诱导Foxp3+Treg细胞分化的作用依赖于上皮细胞。
MG的体液免疫发病机制包括滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cells，Tfh)的异常增殖和生发中心(germinal center，GC)的形成。滤泡辅助型T(follicular helper Tcells，Tfh)细胞，定义为CD4+CXCR5+ICOS+T细胞，主要作用是促进和维持生发中心(germinal center，GC)的形成并促进GC中B细胞的分化，辅助B细胞产生抗体，在体液免疫中发挥了重要的调节作用。其表面的趋化因子受体CXCR5促进Tth细胞向GC的迁移。在MG患者中，胸腺增生与异位生发中心的形成相关，从而促进胸腺中B细胞产生抗AChR的抗体。
Toll样受体9(toll-like receptor9，ILR9)在免疫系统中发挥着重要的作用，能够识别存在于病毒和原核生物基因组中的未甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸，称为CpG基序，而这些二核苷酸通常在宿主DNA中甲基化。TLR9对感染的识别不仅通过诱导树突状细胞(dendritic cells，DCs)激活幼稚T细胞而且促进GC的形成以及B细胞活化和终末分化成分泌抗体的浆细胞从而调节适应性免疫。寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN)H154是TLR9信号通路的特异性抑制剂。其作用机制是通过模仿哺乳动物DNA的免疫抑制活性并干扰下游信号传导，而非通过抑制CpG的结合或摄取。在适应性免疫中，TLR9激活后可促进树突状细胞(dendritic cells，DC)激活naive T细胞、促进生发中心形成、诱导B细胞激活和分化为分泌抗体的浆细胞。在重症肌无力的相关研究中发现，MG患者外周血中TLR9的表达显著高于健康对照组，且MG患者TLR9的mRNA表达升高，与MG的临床严重程度呈正相关，高度提示TLR9可能通过促进体液免疫参与了MG的发病机制。
胸腺对抗乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AChR)抗体的产生发挥了重要的作用。多项研究发现MG患者胸腺巾自然调节性T细胞(natural regulatoUT cells，nTreg)的数量和功能存在缺陷。nTreg在胸腺中产生，移行到外周后通过多种方式发挥免疫抑制作用诱导免疫耐受，维持免疫稳态。胸腺nTreg细胞的发育受多种因素影响。其分化主要依赖于胸腺基质细胞，包括胸腺上皮细胞(thymic epithelial cells.TEC)和胸腺树突状细胞(thymic dendritic cells，tDC)。发育中的胸腺细胞在皮质内通过皮质上皮细胞(cortical thymic epithelial cells,cTEC)进行阳性选择，随后进入髓质与髓质上皮细胞(medullary thymic epithelial cells、mTEC)或tDC接触并进行阴性选择。在胸腺髓质内通过与表达MHCⅡ分子的细胞相互作用，在双阳性(double positive，DP)阶段分化为Treg细胞，在这个过程中开始表达Foxp3并分化成Foxp3+Treg细胞。
外泌体为直径30-150nm的细胞外囊泡，功能涉及T细胞，B细胞和DC等方面，与多种自身免疫疾病相关。我们课题组前期的研究发现他汀类药物可诱导耐受性DC，此耐受性DC具有调节细胞免疫和体液免疫的作用，从而缓解实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)大鼠的临床症状。之后，我们通过超离心的方法可分离他汀类药物诱导的耐受性DC所分泌的外泌体(statin-Dex)或DMSO处理的DC所分泌的外泌体(DMSO-Dex)，并且证明了statin-Dex可缓解EAMG大鼠的临床症状，这种治疗作用主要是通过上调了胸腺和外周淋巴器官中Foxp3+Treg细胞。
基于以上研究背景，本论文的目的旨在寻求重症肌无力的治疗靶点。一方面我们推测TLR9信号通路异常激活诱导的体液免疫反应增强在MG的发病机制中发挥了重要的作用，然而目前未有涉及TLR9信号通路在MG中的研究。另一方面，statin-Dex诱导EAMG免疫耐受的作用虽已证实，但其促进胸腺中nTreg分化的机制尚不明确，胸腺作为重要的中枢免疫器官，在重症肌无力的发病机制中扮演了重要角色。因此，研究内容主要从两部分人手，分别探究TLR9信号通路在MG中的调节作用及statin-Dex对胸腺Treg的诱导作用及机制。
目的：
一、通过应用TLR9信号通路的抑制剂来干扰EAMG大鼠模型，探索TLR9信号通路在EAMG体液免疫中的作用并寻求MG的治疗方法。
二、探讨statin-Dex上调EAMG大鼠胸腺内Treg细胞的机制，从而临床重症肌无力的治疗提供新的策略。
方法：
第一部分:
1.EAMG大鼠模型建立及临床评分
在雌性Lewis大鼠尾根部皮下注射200μl乳化的R-AChR97-116肽段，第30天时加强免疫一次。免疫当天记为第0天，此后每隔一天记录体重和临床评分，临床症状评估标准为:0，正常;1，活动度轻度下降，抓握力降低，声音轻微嘶哑，重复抓握后更明显;2，重复抓握前出现即出现临床症状（震颤，低头，弓背，抓握力明显减弱）;3，运动前出现严重临床症状，不能抓握，垂死状态;4，死亡。
2.ODN治疗
分别在免疫后的第5、12、19、26、30、37和44天，给予每组大鼠腹腔注射100μg对照ODN序列（5’-TCC-ATG-AGC-TTC-CTG-ATGCT-3’），或等剂量的TLR9抑制剂H154(5’-CCT-CAA-GCT-TGA-GGGG-3’)。
第二部分:
1.EAMG模型的建立及外泌体治疗
使用含有结核杆菌的完全弗氏佐剂乳化AChR97-116肽段，在大鼠尾根部皮下注射诱导EAMG模型。
雌性Lewis大鼠分成三组。一组注射PBS作为对照，另外两组分别注射DMSO或他汀类药物处理的BMDCs分泌的外泌体。分别在免疫后第5天，第10天和第15天给予外泌体治疗。免疫后第20天处死大鼠。
2.骨髓树突状细胞的培养和外泌体的分离
取6-8周龄的Lewis大鼠胫骨和股骨，冲洗骨髓腔并过滤。裂解红细胞后，重悬于含有重组大鼠(rr)GM-CSF和rrIL-4的培养基中。孵育72小时后，轻轻除去非贴壁细胞，进一步培养贴壁细胞。在第7天，收获漂浮细胞和松散粘附的细胞，加入二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)或溶于DMSO中的阿托伐他汀培养48小时后，收集上清液用于分离外泌体。
结果：
第一部分:
1.阻断TLR9信号通路缓解EAMG大鼠的临床症状
在免疫后第34天至第46天，H154组大鼠的平均临床评分低于对照ODN组的大鼠，但两组大鼠临床症状出现的时间相同（均为免疫后第34天）。在疾病高峰期，H154组大鼠的平均临床评分为0.7±0.27，对照组为1.58±0.20。两组之间的临床评分差异在免疫后第36、38、42、44和46天具有统计学意义。
2.阻断TLR9信号通路抑制EAMG大鼠体内的抗体产生
与对照组相比，H154组的火鼠体内IgG(*p＜0.05)、IgG2a(*p＜0.05)和IgG2b水平均降低(p=0.62)。此外，随着疾病的进展，EAMG大鼠血清中IgG抗体水平持续增加，尤其是强化免疫后，说明本实验中的EAMG动物模型可模拟临床疾病。
第二部分:
1.外泌体鉴定
DMSO-Dex和statin-Dex的颗粒直径主要分布在70-140nm范围内。电子显微镜下可观察到外泌体的完整形态，直径约1OOnm。通过Western方法检测TSGl01（一种成熟的外泌体标记物），可观察到两组外泌体均表达TSG101,大小为49kDa。
2.外泌体主要分布于胸腺内皮质及皮髓质交界处
外泌体主要位于胸腺内皮质以及皮质和髓质之间的交界处。DMSO-Dex组和statin-Dex组之间的分布无明显差异。此外，可观察到外泌体被角蛋白阳性的胸腺上皮细胞吞噬。
结论:
一、TLR9通路在EAMG的发病机制中发挥重要作用。应用抑制性ODN序列H154阻断TLR9通路可下调EAMG人鼠Tfh细胞和生发中心B细胞比例，从而减少抗AChR抗体产生和抗体类别转换，并最终缓解重症肌无力临床表现。
二、statin-Dex可上调胸腺内Foxp3+Treg的比例。statin-Dex和DMSO-Dex均可升高胸腺基质细胞CD40的表达，但只有statin-Dex可增加mTEC内的Aire表达。statin-Dex和DMSO-Dex在体外诱导Foxp3+Treg细胞分化的作用依赖于上皮细胞。