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本实验进行以下四个方面的研究: 一.日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj14FABP)多价疫苗pVIVO2-IL12-Sj14FABP和单价疫苗pVIVO2-Sj14FABP的构建和鉴定 目的：构建日本血吸虫14kDa脂肪酸结合蛋白(Sj14FABP)多价疫苗pVIVO2-IL12-Sj14FABP和单价疫苗pVIVO2-Sj14FABP。方法：RT-PCR扩增Sj14FABP目的片段:为获得日本血吸虫脂肪酸结合蛋白Sj14FABP基因，本研究从GenBank中查找该基因编码序列，设计特异性的上游引物P1和下游引物P2，分别带有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。收集日本血吸虫新鲜成虫，用TRIzol试剂提取总RNA，Reverse Transcriptase逆转录获得cDNA第一链，Sj14FABP特异性引物P1和P2进行PCR，产物经过双酶切回收后定向克隆到真核表达载体pVIVO2和pVIVO2-IL12中，构建重组质粒pVIVO2-Sj14FABP和pVIVO2-IL12-Sj14FABP，将其转化大肠杆菌GT110，潮霉素筛选转化子，通过PCR和双酶切鉴定阳性克隆，并进行序列测定。结果：RT-PCR扩增出一条大小约为440bp的目的片段;分别以重组质粒pVIVO2-Sj14FABP和pVIVO2-IL12-Sj14FABP为模板进行PCR和双酶切，均能得到与RT-PCR产物同样大小的DNA片段;序列分析显示:日本血吸虫Sj14FABP的编码基因全长为399bp，同文献报道的序列同源性为99.75％。结论：RT-PCR成功扩增Sj14FABP的基因片段，多价疫苗pVIVO2-IL12-Sj14FABP和单价疫苗pVIVO2-Sj14FABP构建成功。 二.日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj14FABP)的表达 1.Sj14FABP在体外HepG2细胞中的瞬时表达 2.Sj14FABP在BALB/c小鼠体内骨骼肌细胞的表达 3.Sj14FABP的原核表达 三.日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj14FABP)DNA疫苗的免疫保护性试验 目的：研究细胞因子IL-12与日本血吸虫脂肪酸结合蛋白（Sj14FABP）共价DNA疫苗优势诱导Th1型应答对小鼠的免疫保护性作用。方法：50只雄性BALB/c小鼠随机分为A、B、C、D和E5组，每组10只。A组:0.9％NaCl100μl/只;B组:pVIVO2100μg/只; C组: pVIVO2-Sj14FABP100μg/只， D组:pVIVO2-IL12-Sj14FABP100μg/只;E组:pVIVO2-Sj14FABP和pVIVO2-IL12各50μg，分别肌肉注射免疫1次。免疫后30d每鼠感染40±2条尾蚴，感染后45 d剖杀，计数成虫虫荷和肝脏每克虫卵数(EPG);并将A、B、C和D组小鼠肝脏用常规方法石蜡包埋、切片，H.E.染色，进行虫卵肉芽肿直径、面积测量。为了观察多抗原分子DNA疫苗联合能否提高对小鼠的免疫保护性，设立pVIVO2-IL12-Sj14FABP和pVIVO2-IL12-Sj23联合免疫组。结果：1.pVIVO2-IL12-Sj14FABP组与生理盐水对照组相比，获得了39.43％的减虫率和32.8％的减卵率，且肝脏虫卵肉芽肿的直径和面积均明显减小(P＜0.01);而单价pVIVO2-Sj14FABP组所诱导的减虫率和减卵率分别为24.11％和27.2％，肝脏虫卵肉芽肿的平均直径和面积也显著减小(P＜0.01或0.05)。2.pVIVO2-Sj14FABP和pVIVO2-IL12混合组与生理盐水对照组相比，获得了38.83％的减虫率和40.27％的减卵率，但与共价疫苗pVIVO2-IL12-Sj14FABP免疫组结果之间的差异均无统计学意义(P＞0.05)。3.pVIVO2-IL12-Sj14FABP和pVIVO2-IL12-Sj23联合免疫组较pVIVO2-IL12-Sj14FABP免疫组获得了更高的减虫率和减卵率，分别为45.29％和47.33％。结论：日本血吸虫脂肪酸结合蛋白DNA疫苗pVIVO2-Sj14FABP能够在小鼠体内诱导部分保护性免疫力;而细胞因子IL-12能够增强血吸虫DNA疫苗的免疫保护效果;混合疫苗诱导小鼠的保护力与共价疫苗相比无显著性差异;而多个抗原DNA疫苗联合免疫的保护性效果明显优于单个抗原DNA疫苗。 四.多价DNA疫苗pVIVO2-IL12-Sj14FABP诱导的免疫反应特点 目的：初步研究多价DNA疫苗pVIVO2-IL12-Sj14FABP在小鼠体内诱导的部分保护性免疫机制。方法：研究对象为第三部分的A、B、C和D组小鼠，分别于免疫前、免疫后30d及感染后45d收集小鼠血清，ELISA法测定血清中总IgG水平，并以双夹心ELISA检测免疫前和免疫后30d小鼠血清中IL-12含量。感染后45d剖杀小鼠，制备单个脾淋巴细胞悬液，分别用ConA(5μg/ml)和SEA(10μg/ml)作为刺激原培养72h，以ELISA试剂盒检测培养上清中细胞因子IL-4、IL-2和IFN-γ的含量。结果：1.各实验组小鼠在免疫后30d总IgG水平与免疫前无显著性差异，而攻击感染后45d，IgG抗体滴度均明显升高。但免疫后30d与感染后45d，pVIVO2-IL12-Sj14FABP及pVIVO2-Sj14FABP两免疫组与对照组之间的差异均无统计学意义。2.免疫后30d pVIVO2-IL12-Sj14FABP组小鼠血清IL-12平均含量为399.34pg/ml，与免疫前相比明显升高，且显著高于其它组（P均＜0.01）。3.细胞因子检测结果示:D组（pVIVO2-IL12-Sj14FABP免疫组）小鼠脾细胞诱生的IL-2和IFN-γ水平，在ConA和SEA刺激下较A组（生理盐水对照组）明显增高(P＜0.01或0.05)，而Th2型细胞因子IL-4的水平在ConA和SEA刺激下D组均明显低于A组，经统计学比较有显著性差异(P＜0.01）。结论：携带鼠IL-12的多价疫苗pVIVO2-IL12-Sj14FABP免疫动物，能够激发机体内源性IL-12的分泌，诱导以Th1型细胞为主的免疫应答。 本项研究结果可得出以下结论:1.日本血吸虫脂肪酸结合蛋白（Sj14FABP）与细胞因子IL-12共价DNA疫苗pVIVO2-IL12-Sj14FABP构建成功;2.pVIVO2-IL12-Sj14FABP可在体外哺乳动物细胞（HepG2）和小鼠体内骨骼肌细胞中有效表达目的蛋白分子Sj14FABP，且表达产物具有抗原性;3.DNA疫苗pVIVO2-IL12-Sj14FABP可诱导小鼠产生较高的抗血吸虫攻击感染的免疫保护力，获得39.43％的减虫率和32.8％的减卵率，保护作用高于单价DNA疫苗pVIVO2-Sj14FABP，并能够减轻肝脏肉芽肿的病理变化;4.pVIVO2-Sj14FABP和pVIVO2-IL12混合免疫组诱导的保护性效果与共价疫苗pVIVO2-IL12-Sj14FABP免疫组相比，差异无统计学意义(P＞0.05);5.多个抗原分子疫苗(pVIVO2-IL12-Sj14FABP和pVIVO2-IL12-Sj23)联合免疫可显著提高小鼠抗血吸虫攻击感染的免疫保护力;6.多价疫苗pVIVO2-IL12-Sj14FABP免疫小鼠后，诱导以Th1型细胞为主的免疫应答，从而发挥抗血吸虫感染作用。也证明核酸疫苗诱生的抗感染免疫保护效果，可能同宿主Th1型应答的增强有关;7.初步证明细胞因子IL-12是一种有效的血吸虫疫苗佐剂。