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菊花(Chrysanthemum grandiflorum Ramat.)是世界四大鲜切花之一,观赏和经济价值极高,但切花菊周年生产过程中,普遍存在土壤盐渍化问题,严重影响切花产量与品质。WRKY转录因子在响应各种非生物胁迫中发挥重要作用。本研究以盐胁迫下’神马’菊花叶片为实验材料,采用IlluminaHiSeqTM2000双末端测序技术对菊花进行转录组数据信息分析,克隆得到1个WRKY基因并遗传转化’神马’菊花,为通过分子生物学手段提高栽培菊花的耐盐性提供理论依据。主要研究结果如下:1.利用盐胁迫下菊花叶片为材料建立cDNA文库,采用Illumina HiSeqTM 2000系统进行转录组测序,共获得有效序列0.94亿条,平均长度94.37 bp。序列经组装得到365323个长度大于100 bp的转录本,进一步拼接后,共获得161522条Unigenes。161522条Unigenes全部被比对到公共数据库中,其中比对到GO和KOG数据库的Unigenes分别为12153和23477条,共有25173条Unigenes被KEGG注释参与到306个pathway中,然后根据差异表达基因进行盐胁迫响应基因的筛选。2.从盐胁迫下菊花转录组数据库中筛选1条WRKY基因序列,设计全长引物并克隆得到该WRKY基因的全长基因序列,命名为DgWRKY2。通过生物信息学分析得到了其基因的ORF的片段长度为978 kb,共编码325个氨基酸,氨基酸的分子量为36.55 kDa,理论等电点为PI=6.66,含有1个典型的WRKY结构域(WRKYGQK)和锌指结构(C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H),确定该基因为WRKY转录因子第Ⅲ亚族的成员。将DgWRKY2蛋白与葡萄,胡萝卜等植物的WRKY蛋白做进化树分析,该蛋白与胡萝卜DcWRKY71聚为一支,推测它们具有较近的亲缘关系。3.构建植物表达载体,利用农杆菌介导法将DgWRKY2转入菊花,以CTAB法提取抗卡那霉素转基因菊花的DNA作为模板进行PCR检测,并通过荧光定量检测DgWRKY2在菊花中的表达水平。4.过量表达DgWRKY2的转基因菊花植株在表型上与野生型植株没有明显差别。对DgWRKY2过表达菊花和野生型菊花进行盐胁迫处理并测定相关生理指标。结果表明当转基因菊花受到盐胁迫时,植株体内的抗氧化酶活性、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、叶绿素含量高于野生型,而MDA含量、H202含量、02-含量低于野生型,且DAB和NBT染色也比野生型浅,转基因菊花恢复生长具有更高的存活率,初步证明转基因菊花的耐盐性比野生型菊花有所提高。5.运用实时荧光定量PCR的方法研究了与耐盐相关调控基因CuZnSOD、CAT、APX、P5CS、DREB1A、DREB2A的表达,DgWRKY2基因过表达后通过诱导与ROS信号通路、脯氨酸生物合成信号通路和ABA信号通路相关基因表达上调,从而提高转基因菊花的耐盐性。综上所述,本研究通过过表达DgWRKY2基因,获得转基因’神马’菊花植株,耐盐分析发现转基因植株耐盐性提高,而且转基因菊花对盐胁迫应答功能基因呈现上调表达,表明DgWRKY2基因可以通过脯氨酸生物合成信号转导和ABA信号转导来调控抗逆功能基因的表达从而提高植株的耐盐性。