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目的:本研究旨在研究下调TRAF4基因表达对乳腺癌移植瘤增殖、侵袭和转移的影响,并进一步探讨TRAF4与RSK4在乳腺癌中的相互作用关系及可能存在的作用机制。方法:通过转染LV-shRNA-TRAF4至乳腺癌MDA-MB-231细胞特异性敲低TRAF4的表达,并以LV-shRNA-NC转染作为阴性对照组以及未转染MDA-MB-231细胞作为空白对照组。应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(western blot)分别检测慢病毒转染后细胞中TRAF4 mRNA和蛋白的表达情况。将三组细胞分别通过裸鼠乳腺脂肪垫皮下注射至4-6周雌性BALB/c裸鼠中,并分成三组(n=14):TRAF4-shRNA组,阴性对照组和空白对照组。另外,将上述三组细胞分别通过裸鼠左、右侧尾静脉注射至另15只裸鼠静脉血管中构建体内转移模型,每组5只。每周测量并记录肿瘤的长径和短径,根据肿瘤生长曲线、肿瘤大小和重量评估肿瘤的增殖情况。通过裸鼠原位移植瘤肝、肺转移模型和尾静脉注射体内转移模型获得肺和肝组织,进行组织病理学检测评估敲低MDA-MB-231细胞中TRAF4的表达对乳腺癌细胞侵袭和转移情况的影响。收获移植瘤组织通过免疫组织化学、蛋白质印迹法、实时荧光定量PCR检测TRAF4和RSK4的表达以及AKT/NF-κB相关因子(p-AKT/AKT,p-NF-κB/NF-κB,TGF-β1,TNF-α,MMP2以及MMP9)的表达。结果:1、慢病毒载体及空载病毒载体成功转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞中并稳定表达,qRT-PCR检测细胞中TRAF4 mRNA在TRAF4-shRNA组、阴性对照组和空白对照组三组中相对表达水平依次为0.305±0.062、0.890±0.057、1.000±0.000。可见,TRAF4-shRNA组TRAF4 mRNA的表达明显低于阴性对照组(P<0.05)和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组和空白对照组之间TRAF4 mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot检测细胞中TRAF4蛋白在TRAF4-shRNA组、阴性对照组和空白对照组三组中的表达水平。可见,TRAF4-shRNA组TRAF4蛋白的表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组。2、移植瘤生长曲线结果提示:TRAF4-shRNA组肿瘤生长速率明显低于阴性对照组和空白对照组,而阴性对照组和空白对照组肿瘤生长速率无明显差异。测量TRAF4-shRNA组、阴性对照组和空白对照组三组裸鼠的平均体积依次为304.00±119.00 mm~3、844.00±293.73 mm~3、931.66±293.43 mm~3。可见,三组肿瘤的平均体积差异有统计学意义(P<0.05),经两两比较,TRAF4-shRNA组中肿瘤平均体积明显小于阴性对照组(P<0.05)和空白对照组(P<0.05)的平均体积,而阴性对照组和空白对照组之间的平均体积差异无统计学意义(P>0.05)。测得TRAF4-shRNA组、阴性对照组和空白对照组三组裸鼠移植瘤的平均重量依次为1.93±0.54 g、2.88±0.42 g、3.02±0.26 g,三组肿瘤的平均重量差异有统计学意义(P<0.05),经两两比较,TRAF4-shRNA组中肿瘤平均重量明显轻于阴性对照组(P<0.05)和空白对照组(P<0.05)的平均重量,而阴性对照组和空白对照组之间的平均重量差异无统计学意义(P>0.05)。TRAF4-shRNA组、阴性对照组和空白对照组三组均可见原位移植瘤肺转移灶。TRAF4-shRNA组肺转移灶数量明显少于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组和空白对照组原位移植瘤肺转移灶数量差异无统计学意义(P>0.05)。三组HE染色均未见肝组织发生转移性病变。3、裸鼠尾静脉注射构建体内转移模型结果提示TRAF4-shRNA组肝组织未见转移灶,而阴性对照组和空白对照组均有多个明显肝转移灶。三组肺组织肉眼观及HE染色均未见转移灶。4、免疫组织化学结果提示TRAF4-shRNA组TRAF4相较于阴性对照组和空白对照组明显低表达,而TRAF4-shRNA组RSK4的表达相较于阴性对照组和空白对照组增加,并且RSK4和TRAF4表达之间存在明显的负相关关系(r=-0.645,P<0.05)。qRT-PCR结果显示TRAF4-shRNA组、阴性对照组和空白对照组三组组织中TRAF4 mRNA的相对表达水平依次为0.3050±0.0617、0.8900±0.0572、1.0000±0.0000。TRAF4-shRNA组、阴性对照组和空白对照组三组组织中RSK4 mRNA的相对表达水平依次为3.0670±0.5293、1.1000±0.0927、1.0000±0.0000。可见,TRAF4-shRNA组TRAF4 mRNA表达显著低于相应的阴性对照组和空白对照组,但RSK4mRNA在TRAF4-shRNA组中高表达,在相应的其他两组中低表达。Western blot结果显示TRAF4-shRNA组、阴性对照组和空白对照组三组中TRAF4蛋白的相对表达水平依次为0.347±0.089、1.083±0.153、1.174±0.211。三组中RSK4蛋白的相对表达水平依次是1.217±0.181、0.641±0.124、0.596±0.137。可见TRAF4-shRNA组TRAF4蛋白表达明显低于相应的阴性对照组和空白对照组,而RSK4的蛋白在TRAF4-shRNA组中高表达,在相应的阴性对照组和空白对照组低表达。5、组织qRT-PCR检测TRAF4-shRNA组、阴性对照组和空白对照组三组中MMP2 mRNA相对表达水平依次为0.01830±0.00140、1.07000±0.16619、1.00000±0.00000。三组中MMP9 mRNA相对表达水平依次为0.56000±0.08000、1.10000±0.23180、1.00000±0.00000。可见,TRAF4-shRNA组NF-κB下游因子MMP2和MMP9 mRNA的表达显著低于阴性对照组(P<0.05)和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组和空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果显示TRAF4-shRNA组、阴性对照组和空白对照组三组中p-AKT/AKT依次为0.133±0.056、0.473±0.109、0.469±0.114。三组中p-NF-κB/NF-κB依次为0.117±0.047、0.487±0.146、0.499±0.123。三组中TNF-α/GAPDH依次为0.221±0.097、0.647±0.151、0.709±0.137。三组中TGF-β1/GAPDH依次为0.537±0.117、1.108±0.214、1.189±0.196。TRAF4-shRNA组AKT通路相关蛋白p-AKT表达明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),NF-κB信号通路相关蛋白p-NF-κB,TNF-α,TGF-β1相对于其他两组也明显降低(P<0.05)。结论:1、构建乳腺癌裸鼠移植瘤模型及肝/肺转移模型,明确下调乳腺癌MDA-MB-231细胞株中TRAF4基因的表达明显减弱该细胞株的增殖、侵袭和转移的能力。2、通过检测和分析乳腺癌移植瘤中TRAF4和RSK4基因的mRNA和蛋白的表达,发现TRAF4与RSK4存在负调控关系。3、通过检测和分析AKT/NF-κB通路相关核心蛋白,发现TRAF4对RSK4的作用可能与AKT/NF-κB通路相关。