研究背景：急性T淋巴细胞白血病(Acute T Lymphoblastic Leukemia, T-ALL)是严重威胁人类健康的造血系统恶性疾患,现有的治疗手段虽使该病初治完全缓解率较前有所提高,但大部分患者仍死于难治或复发,新的治疗手段亟待探索。T-ALL的发生发展与淋巴细胞的增殖、分化、凋亡等生物学行为异常密切相关,多项研究显示,组蛋白等的乙酰化水平及WNT/β-catenin信号通路在淋巴细胞的增殖、分化、凋亡等生物学行为异常中起重要作用。核心组蛋白及许多转录因子乙酰化状态的改变在调节基因转录中起重要作用。组蛋白乙酰化酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)两者之间的动态平衡调节组蛋白乙酰化水平。HATs可乙酰化组蛋白n末端赖氨酸残基,使由组蛋白与DNA双链构成的核小体结构变得松散,有利于各种转录因子与DNA的结合,启动基因转录；HDACs则使组蛋白n末端赖氨酸残基去乙酰化,组蛋白处于低乙酰化状态,核小体结构致密,从而抑制转录。除组蛋白外,HDACs和HATs还可通过调节转录因子等蛋白的乙酰化水平从而调控基因表达。研究表明,乙酰化状态的失衡是肿瘤细胞的重要特征,与肿瘤的发生发展密切相关。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetyltransferase, HDACis)是一种极具应用前景的新型抗肿瘤药物,可通过抑制HDACs的活性,提高靶细胞中组蛋白或其它靶蛋白的乙酰化水平,从而调控基因表达,最终达到抑制肿瘤细胞生长的目的。HDACis可有效抑制肺癌、肝细胞癌、前列腺癌、乳腺癌等多种实体瘤细胞的生长,其主要机制包括促进肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞、抑制肿瘤新生血管生成等。有研究显示,HDACis对白血病细胞具有诱导分化、促进凋亡及细胞周期阻滞等作用。但目前有关HDACis在T-ALL细胞中的作用及其机制尚未有人报导,需进一步研究探讨。WNT/β-catenin信号通路是一条进化过程中高度保守的信号通路,以转录辅助因子β-catenin为主要介导因子。研究表明,WNT/β-catenin信号紊乱与多种实体瘤以及血液系统恶性疾患的发生发展密切相关。许多肿瘤细胞中存在WNT/β-catenin信号通路的异常活化,然而,如同许多其它的信号通路,WNT/β-catenin信号在人类肿瘤中的作用具有多面性。根据细胞环境的不同,WNT/β-catenin信号可发挥原癌基因或肿瘤抑制基因的作用。最近研究表明,HDACis可调控WNT/β-catenin信号通路。结肠癌和胰腺癌细胞中,组成性活化的WNT/β-catenin信号参与了疾病的发生发展。HDACis在结肠癌和胰腺癌细胞中可进一步活化WNT/β-catenin信号,且进一步活化的WNT/β-catenin信号似乎与HDACis的抗肿瘤作用有关。有证据表明,T-ALL中存在WNT/β-catenin信号通路的组成性激活,其异常活化亦参与了T-ALL的发生发展。然而,目前尚未有T-ALL中,HDACis对WNT/β-catenin信号的影响以及WNT/β-catenin信号是否参与了HDACis抗肿瘤作用的研究。研究目的：研究HDACis(VPA和SBHA)对T-ALL细胞生物学行为的影响,探讨T-ALL细胞中HDACis与WNT/β-catenin信号通路的关系,阐明HDACis发挥抗T-ALL作用的具体机制,以期为T-ALL治疗提供新思路。研究方法：1. HDACis对T-ALL细胞生物学行为的影响1.1MTT实验检测HDACis对T-ALL细胞增殖的影响：T-ALL细胞系Jurkat和Molt-4分别用不同浓度的VPA或SBHA处理24h、48h、72h,MTT实验检测不同浓度VPA或SBHA对T-ALL细胞增殖的抑制作用。1.2流式细胞术PI染色检测细胞周期：Jurkat和Molt-4细胞经VPA(1mM)或SBHA(10μM)处理24h后,PI染色,利用流式细胞术检测不同浓度VPA或SBHA对T-ALL细胞的周期阻滞作用。1.3Western blot检测凋亡及细胞周期相关蛋白表达：Jurkat和Molt-4细胞用VPA(1mM)或SBHA(10μM)处理48h后收集细胞,提取细胞总蛋白后进行SDS-PAGE凝胶电泳,Western blot方法检测不同浓度VPA或SBHA对T-ALL细胞内调亡相关蛋白表达的影响。2. HDACis对T-ALL细胞中WNT/β-catenin信号通路的影响2.1Western blot:T-ALL细胞系Jurkat和Molt-4加入VPA(0.5,1mM)或SBHA(5,10μM)孵育48h后,收集细胞,应用RIPA裂解液提取细胞总蛋白和核蛋白,western blot方法检测HDACis处理后T-ALL细胞内P-catenin蛋白的表达变化。2.2免疫细胞化学染色：将VPA(1mM)或SBHA(10μM)处理的Jurkat和Molt-4细胞均匀滴于防脱载玻片上,免疫细胞化学方法检测HDACis处理对Jurkat和Molt-4细胞内β-catenin蛋白表达分布的影响,并利用IPP软件对免疫化学染色的光密度进行分析。2.3Real time RT-PCR:收集经VPA(0.5,1mM)或SBHA(5,10μM)处理48h的Jurkat和Molt-4,提取总RNA, real time RT-PCR方法检测HDACis处理后T-ALL细胞内β-catenin mRNA的表达变化。2.4双荧光素酶报告基因实验：Jurkat细胞核转染报告质粒TOPflash/MOPflash和内参pRL-TK后,加入VPA(1mM)或SBHA(10μM)孵育24h,双荧光素酶报告基因实验检测报告荧光强度。3. HDACis对T-ALL细胞的抑制作用与WNT/β-catenin信号的关系3.1细胞转染：应用LipofectamineTM2000将携带β-catenin特异性shRNA干扰片段的质粒或对照质粒分别转染T-ALL细胞系Jurkat,并用G418筛选至少2周,获得稳定表达β-catenin特异性shRNA或对照shRNA的Jurkat细胞。将稳定转染的Jurkat细胞分别命名为JK-β-catenin-shRNA和JK-control-shRNA。应用real time RT-PCR和western blot方法分别检测稳定转染β-catenin特异性shRNA或对照shRNA的细胞β-catenin表达情况。3.2MTT实验检测转染shRNA后T-ALL细胞对HDACis的药物敏感性：将JK-β-catenin-shRNA和JK-control-shRNA细胞分别接种于细胞培养板中,加入不同浓度的VPA或SBHA孵育48h,MTT实验检测细胞对HDACis的药物敏感性,并计算IC50值。3.3流式细胞术Annexin V-APC/PI双染法细胞凋亡：将转染后的JK-β-catenin-shRNA和JK-control-shRNA细胞分别接种于12孔板中,加入VPA(1mM)或SBHA(10μM)处理24h,利用流式细胞术Annexin V-APC/PI双染法检测细胞凋亡率的变化。3.4MTT实验检测上调β-catenin表达后HDACis药物敏感性的变化：BIO上调β-catenin表达：将Jurkat细胞接种于细胞培养板中,加入不同浓度的BIO(6-bromoindirubin-3’-oxime)孵育24h,western blot方法检测β-catenin蛋白的表达,MTT实验检测BIO对Jurkat细胞的增殖抑制情况,从而选择合适浓度的BIO进行下一步实验。将Jurkat细胞接种于96孔板中,加入BIO(0.5μM)和不同浓度的VPA或SBHA孵育48小时,MTT实验检测加入BIO后,细胞对VPA或SBHA敏感性的变化并计算IC50值。研究结果：1. HDACis通过多种途径对T-ALL细胞发挥抗白血病作用1.1VPA和SBHA抑制T-ALL细胞增殖：将Jurkat和Molt-4细胞接种96孔板,加入不同浓度的VPA和SBHA孵育24h、48h、72h后,MTT实验结果表明,VPA和SBHA可显著抑制Jurkat和Molt-4细胞的增殖,且增殖抑制作用具有剂量、时间依赖性的特点。1.2VPA和SBHA将T-ALL细胞周期阻滞于G2/M期：流式细胞术PI染色法结果显示,T-ALL细胞经DMSO、VPA(1mM)和SBHA(10μM)处理后,G2/M期细胞的百分比为：Jurkat细胞分别为9.52±1.03,29.09±0.91,42.42±9.66；Molt-4细胞分别为6.70±0.39,12.29±0.96,51.44±11.09,差异具有显著统计学意义(P<0.01),提示VPA或SBHA均可将T-ALL细胞周期阻滞于G2/M期,其中SBHA(10μM)G2/M期阻滞作用更显著。进一步研究发现,VPA和SBHA可上调Jurkat和Molt-4细胞中p21WAF1的表达,这可能和VPA和SBHA引起的G2/M期阻滞相关。1.3VPA和SBHA诱导T-ALL细胞凋亡：Western blot实验结果显示,Jurkat和Molt-4细胞经VPA(0.5mM,1mM)或SBHA(5μgM,10μM)处理48h后,caspase-9, caspase-3和PARP的裂解片段表达水平呈剂量依赖性增高,表明VPA和SBHA可诱导T-ALL细胞发生内源性细胞凋亡。2.VPA和SBHA上调T-ALL细胞中WNT/β-catenin信号通路2.1VPA和SBHA上调β-catenin蛋白并促进其核内转移：western blot结果显示,经VPA或SBHA处理后,Jurkat和Molt-4细胞总蛋白和核蛋白内β-catenin蛋白水平均显著升高；免疫细胞化学染色结果显示,VPA和SBHA处理的T-ALL细胞中β-catenin免疫化学染色较对照细胞显著加深,IPP软件分析结果亦显示,VPA和SBHA处理的T-ALL细胞内,β-catenin的免疫化学染色光密度值显著高于对照细胞。上述结果说明VPA和SBHA可上调T-ALL细胞内β-catenin的表达且促进其核内转移。2.2VPA和SBHA增强Jurkat细胞内β-catenin依赖的转录活性：双荧光素酶报告基因实验结果显示,VPA和SBHA处理的Jurkat细胞TCF报告质粒的相对荧光信号分别为14.73±1.59和16.44±1.22,而DMSO处理的对照细胞仅为7.11±0.89,差异有统计学意义(P<0.05)。这表明VPA和SBHA可上调Jurkat细胞中WNT/β-catenin信号的活性。2.3VPA和SBHA未改变Jurkat细胞β-catenin的mRNA水平：Real time RT-PCR实验结果显示,经VPA或SBHA处理48h后,T-ALL细胞系Jurkat细胞中β-catenin mRNA水平并无明显变化,这表明HDACis对T-ALL细胞中β-catenin的上调并不是发生在转录水平。3. HDACis的抗T-ALL作用部分由WNT/β-catenin信号介导3.1转染shRNA成下调T-ALL细胞内β-catenin的表达：收集转染后的JK-β-catenin-shRNA和JK-control-shRNA细胞进行real time RT-PCR及western blot实验以检测β-catenin的表达,结果显示JK-β-catenin-shRNA细胞中β-catenin在mRNA及蛋白水平均显著低于JK-control-shRNA细胞,说明靶向β-catenin的shRNA成功下调了Jurkat细胞中β-catenin的表达。3.2下调β-catenin减弱T-ALL细胞对HDACis的药物敏感性：MTT检测发现,低表达P-catenin的JK-p-catenin-shRNA细胞中VPA及SBHA的IC50值分别为3.50±0.28mM,30.32±1.82μM；对照JK-con-shRNA细胞中VPA和SBHA的IC50值分别为2.42±0.14mM,17.54±2.66μM,差异有统计学意义(P<0.01)表明shRNA靶向下调β-catenin减弱了T-ALL细胞对VPA和SBHA的药物敏感性。3.3下调β-catenin减弱HDACis诱导的T-ALL细胞凋亡：JK-p-catenin-shRNA和JK-control-shRNA细胞用VPA(1mM)或SBHA(10μM)处理18h后,应用Annexin V/PI双染法对细胞染色,并用流式细胞术分析凋亡细胞的比率。结果显示,VPA或SBHA处理后,JK-control-shRNA细胞中Annexin V阳性细胞由3.66%(DMSO对照)分别增加到29.56%(VPA)或26.89%(SBHA)。与之相比,JK-β-catenin-shRNA中Annexin V阳性细胞则由1.30%(DMSO对照)增加到15.75%(VPA)或11.83%(SBHA),与此一致, western blot结果显示,shRNA靶向下调β-catenin减弱了VPA和SBHA导致的Jurkat细胞内cleaved-PARP的表达。由此可见,shRNA靶向下调β-catenin减弱了HDACis诱导的T-ALL细胞凋亡3.4上调β-catenin增强T-ALL细胞对VPA和SBHA的敏感性：Jurkat细胞用不同浓度的BIO处理48h,western blot结果显示,BIO可诱导Jurkat细胞内β-catenin的表达呈剂量依赖性增高。0.5μM BIO(增殖抑制率为5.27%)即可明显上调Jurkat细胞总蛋白和核蛋白中β-catenin的表达。Jurkat细胞加入BIO(0.5μM)和不同浓度的VPA或SBHA孵育48小时,MTT结果显示,未加BIO的Jurkat细胞中VPA和SBHA的IC50值分别为I.38±0.13mM,22.03±1.07μM,而加入BIO的Jurkat细胞中VPA和SBHA的IC50值明显降低,分别为1.04±0.01mM,7.40±0.81μM,差异有统计学意义(P<0.01)。表明β-catenin过表达可增强T-ALL细胞对VPA和SBHA的敏感性。结论：1. HDACis可通过诱导T-ALL细胞G2/M期阻滞及诱导凋亡抑制细胞增殖,发挥抗T-ALL作用。2. HDACis可活化T-ALL细胞中WNT/β-catenin信号通路。3. HDACis对T-ALL细胞的抗白血病作用至少部分由WNT/β-catenin信号所介导。利用HDACis增强WNT/β-catenin有望成为治疗T-ALL的新靶点,为T-ALL的治疗提供新的策略。