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选题依据:黄芪是具有补气升阳、利水消肿、固表止汗功效的补益类中药,其活性成分以黄芪多糖、黄酮类、皂苷类为主,具有调节免疫功能、抗肿瘤、调节机体代谢及抗衰老等多种药理作用。针对其利水消肿的功效,黄芪在干预肾病综合征、肾性水肿、慢性肾小球肾炎方面发挥出良好的疗效。课题组通过复制阿霉素肾病大鼠模型,对比以山西浑源二等黄芪作为君药的防己黄芪汤全方与缺黄芪阴性方的药效差别,结果显示缺黄芪的阴性方药效明显减弱,而单独给肾病大鼠灌胃黄芪水提物后发现蛋白尿、体重、脏器指数等传统药效指标均有不同程度的回调,从而确证山西浑源二等黄芪的水提物干预阿霉素肾病疗效确切。那么,黄芪水提物干预阿霉素肾病大鼠的作用机制是什么?不同商品规格等级黄芪的水提物干预阿霉素肾病是否有药效差异?药效物质基础是什么?目前尚未从分子和化学层面对其进行系统的研究。本研究拟对黄芪水提物干预阿霉素肾病的作用机制和药效物质基础进行研究,为中药黄芪在肾病综合征的临床应用提供研究基础。目的:本课题以不同商品规格等级黄芪的水提物为研究对象,采用阿霉素诱导的MPC5细胞损伤模型与阿霉素肾病大鼠模型,通过转录组学、细胞生物学、化学分析、多元统计分析和网络药理学技术等多学科方法阐明黄芪水提物干预阿霉素肾病的作用机制及药效物质基础,为黄芪相关药物的进一步研发奠定基础,为指导临床合理选用黄芪等级药材提供研究基础。方法:1、以山西浑源二等黄芪为研究对象,通过对空白组、阿霉素肾病模型组、黄芪水提物给药组大鼠的血清生化指标进行检测,对各组肾组织进行HE染色和透射电镜观察来评价黄芪水提物干预阿霉素肾病大鼠的药效。通过对肾脏组织进行转录组测序,筛选出黄芪水提物干预阿霉素肾病的关键靶基因和关键通路,并采用细胞生物学与多种分子生物学技术验证关键靶基因与关键通路的准确性。2、以不同商品规格等级黄芪的水提物为研究对象,采用阿霉素诱导的MPC5细胞损伤模型筛选出保护作用较大的商品规格等级黄芪的水提物,对筛选出商品等级黄芪的水提物进行化学成分分析,进而采用多元统计分析法明确引起保护作用差异的化学成分类别及其量比关系。3、采用转录组学和网络药理学相结合的方法,筛选出黄芪水提物干预阿霉素肾病大鼠的关键药效成分,并采用阿霉素诱导的MPC5细胞损伤模型验证筛选出的药效成分的活性。结果:1、血清生化检测结果表明,模型组大鼠血清尿素氮,甘油三酯和总胆固醇水平升高,白蛋白和总蛋白水平降低,给予浑源二等黄芪的水提物干预后各指标均有所回调;肾组织HE染色与透射电镜结果表明,模型组大鼠肾小管上皮细胞萎缩,管腔变大、肾小球足细胞足突融合、部分脱落、基底膜增厚、内皮细胞轮廓模糊,给药后肾小管上皮细胞管腔间隙缩小、足突融合减轻,仅局部融合,有完整的足突存在,内皮细胞轮廓清晰;以上结果表明浑源二等黄芪水提物对阿霉素肾病大鼠有较好的药效。肾组织转录组测序结果表明,黄芪水提物发挥肾脏保护作用的关键靶蛋白和通路可能是PI3K-Akt signaling pathway(包括Col6a6、Nr4a1、Sgk1、Gng7)和脂质代谢过程中相关基因(包括Cpt1b、Pcsk9、Abca1、Ascm5);荧光定量PCR检测关键靶基因的表达量与转录组测序的表达趋势一致;关键通路的验证结果表明,黄芪水提物可显著降低阿霉素诱导的MPC5损伤细胞内ROS表达水平,通过激活PI3K-AKT信号通路保护阿霉素诱导的MPC5细胞凋亡。2、不同商品规格等级黄芪的水提物对阿霉素诱导的MPC5细胞损伤的保护作用强弱与药材等级并非一一对应。同一产地不同等级黄芪的水提物保护阿霉素诱导的MPC5细胞损伤的作用排序为:仿野生芪,浑源二等>浑源一等>浑源特等>浑源三等;移栽芪,应县小选>应县大选>应县统货、陇西小选>陇西大选>陇西统货。同一产地不同种植方式的黄芪保护作用对比表明,浑源仿野生黄芪优于应县移栽芪。不同产地同一种植方式黄芪的水提物保护作用对比表明,陇西移栽黄芪优于应县移栽黄芪。不同产地不同种植方式黄芪的水提物保护作用对比表明,浑源仿野生芪优于陇西移栽芪。黄芪水提物的化学分析与多元统计分析结果表明,9种化学成分(Astragaloside IV、Ononin、Calycosin-7-O-glc-6-O-acetate、7,2’-Dihydroxy-3’,4’-dimethoxyisoflavan、Astraisoflavan-7-O-β-D-glucoside、7-hydroxy-6,4’-dimethoxyisoflavan、Formononetin、Isoastragaloside I、Astragaloside I)对保护MPC5细胞损伤有保护作用贡献,其含量的差异和不同的量化组成可能是引起MPC5损伤细胞保护作用差异的主要原因。3、转录组学结合网络药理学筛选黄芪水提物的药效成分结果表明,黄芪甲苷、芒柄花素、槲皮素和毛蕊异黄酮,4种化合物累积贡献率达87.28%。细胞实验验证结果表明,4种活性成分对阿霉素诱导的MPC5细胞损伤有明显的保护作用,均能显著提高MPC5细胞Podocin蛋白的表达。其中黄芪甲苷对ADR诱导的MPC5细胞损伤的最佳保护浓度为6.25μg/mL,芒柄花素的最佳保护浓度为3.125μg/mL。毛蕊异黄酮的最佳保护浓度为6.25μg/mL,槲皮素的最佳保护浓度为3.125μg/mL。结论:黄芪水提物通过降低阿霉素诱导的MPC5损伤细胞内ROS表达水平,激活PI3K-AKT信号通路保护阿霉素诱导的MPC5细胞凋亡。此外,黄芪水提物可能通过作用于脂质代谢相关基因(包括Cpt1b、Pcsk9、Abca1、Ascm5)干预AN大鼠肾组织的脂质代谢,其干预阿霉素肾病的关键药效成分是黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、槲皮素、芒柄花素。