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目的:探讨人晶状体上皮细胞株SRA01/04中衰老标记蛋白30(senescence marker protein30,SMP30)的改变在高钙及急性氧化应激状态下的反应,为进一步研究年龄相关性白内障发病机制提供理论依据,并且在预防白内障的发生发展中提供重要的依据。 方法:1.建立SMP30过表达和沉默稳定株:将人晶状体上皮细胞株SRA01/04细胞按5x104/孔接种于6孔板细胞培养板中,待细胞生长到20%时根据MOI=5使用过表达慢病毒(LV-RGN,19544-1)及沉默慢病毒(LV-RGN_RNAi,50743-1)以及相应的空载对照组慢病毒感染细胞,按常规培养方式培养24小时后将培养液更换成正常培养液。培养72小时后在荧光显微镜下观察转染效率。细胞生长到90%时加入2μg/ml嘌呤霉素,筛选出成功转染细胞。将所得转染细胞提取所需RNA及蛋白进行实时定量聚合酶链反应及蛋白质印迹检测细胞株转染效率,确认模型构建成功。2.观察高钙培养状态下SMP30基因及蛋白的变化:将转染细胞培养至80%时加入15mmol/L CaCl2作用24小时,再提取所需RNA及蛋白检测SMP30基因及蛋白的表达量。3.观察急性氧化应激培养状态下SMP30基因和蛋白的变化:将转染细胞培养至80%加入300μmol/L H2O2作用2小时后提取RNA及蛋白检测此状态下的SMP30基因和蛋白的表达量。 结果:1.衰老标记蛋白30过表达(Over-expression,OE)及沉默(Knock-down,KD)稳定株的转染效率:RT-PCR结果显示OE组(2.8330±0.201)与NC-OE(Over-expression negative control group,过表达空载组)组(0.987±0.888)相比表达丰度为2.83倍(t=-20.309,p=0.003<0.05);KD组(0.090±0.040)与NC-KD(Knock-down negative control group,沉默空载组)组(1.009±0.006)相比敲减率为91%(t=-0.047,p=0.000<0.05)。WB结果显示:OE组(0.923±0.013)的SMP30蛋白表达量较NC-OE组(0.599±0.013)上调(p=0.000<0.05),KD组(0.610±0.002)较NC-KD组(0.742±0.013)下调(p=0.000<0.05)。2.高钙培养状态下SMP30蛋白及RGN mRNA基因表达量:RT-PCR结果显示OE组(5.234±0.512)RGN mRNA基因表达量较NC-OE组(1.007±0.149)上调(p=0.000<0.05),KD组(0.510±0.023)表达量较NC-KD(1.006±0.137)组下调(p=0.022<0.05);WB结果显示OE组(0.5668±0.0113)的SMP30蛋白表达量相比NC-OE组(1.107±0.006)下调(p=0.000<0.05),KD组(1.266±0.034)表达量较NC-KD组(1.099±0.026)上调(p=0.003<0.05)。与正常状态下的OE组及KD组相比,RGN mRNA基因表达量均出现反应性增加(pOE=0.002<0.05,pKD=0.000<0.05),而SMP30蛋白表达量在OE组中下调(p=0.000<0.05),KD组中上调(p=0.000<0.05)。3.急性氧化应激状态下各组基因与蛋白的表达量:RT-PCR结果显示OE组(4.332±0.264)RGN mRGN基因表达量较NC-OE组(1.001±0.050)上调(p=0.002<0.05),KD组(0.377±0.029)表达量较NC-KD组(1.004±0.112)下调(p=0.001<0.05);WB结果显示OE组(1.103±0.002)的SMP30蛋白表达量较NC-OE组(0.876±0.010)上调(p=0.000<0.05),KD组(0.611±0.024)的表达量与NC-KD组(0.591±0.034)相比无统计学意义(p=0.46>0.05)。与正常状态相比OE组及KD组RGN mRGN基因表达量均出现反应性增加(pOE=0.001<0.05,pKD=0.001<0.05),SMP30蛋白表达量在OE组中上调(p=0.000<0.05),KD组表达量无统计学意义(p=0.967>0.05)。 结论:构建过表达SMP30及沉默SMP30模型成功,可用于后续研究。在急性氧化应激状态下,与正常状态相比,SMP30过表达组SMP30表达量增加更为明显,提示在急性氧化应激时SMP30出现反应性增加,可能参与HLECs氧化应激的过程。在高钙状态下,SMP30表达量出现反应性改变,提示SMP30与细胞内钙稳态密切相关,发挥其钙调节作用。