背景与目的WHO统计显示肿瘤患者中肺癌发病率在男性排第一,女性排第二。肺癌5年生存率平均为9%~13%,即使是早期手术患者,5年的生存率也仅在18%左右。肺腺癌在肺癌中的比例上升速度很快,已成为肺癌的主要病理类型,其发病率占肺癌总数的30% ~40%。肺腺癌的复发率高,容易发生早期转移,目前的治疗方法不能令人满意。肿瘤干细胞理论认为肿瘤起源于肿瘤内的肿瘤干细胞,这些细胞具有自我更新能力和多向分化的潜能,是肿瘤转移和复发的根源,也是肿瘤对化疗和放疗不敏感的原因。Eramo等人于2007年鉴定了人肺癌干细胞,为肺腺癌干细胞的研究起到了积极地推动作用。正常肺干细胞是如何转换为肺腺癌干细胞的?肺腺癌干细胞具有怎样特异性的标志?这些问题的解决对肺腺癌的发病机理、早期诊断和治疗具有重要意义。因此,我们设计了以下实验:分离并鉴定肺腺癌干细胞,通过基因表达谱分析建立肺腺癌干细胞特异性表达谱,通过生物信息学筛选适宜的肺腺癌干细胞特异性标志并进行鉴定。方法第一部分人体肺腺癌干细胞的分离和鉴定:1.肺腺癌和正常肺组织干细胞的分布:CD133-PE和CD326-FITC双标记免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜检查;2.干细胞的分离:采用磁珠分选法,将制备的单细胞悬液用CD133-PE标记,磁珠分选系统分选细胞,荧光显微镜下检测分离细胞的纯度;3.肺腺癌干细胞的培养:在无血清培养基中培养,每3天半量换液,观察细胞形态;4.肺腺癌干细胞增殖实验:在96孔板中培养干细胞,WST法测定细胞增殖水平,第0,4,6,8,天测定OD450值,绘制增殖曲线图;5.成瘤实验:4周龄NOD/SCID小鼠15只,随机分为A、B、C 3组,每组5只。每只NOD/SCID小鼠近右后肢皮下接种分选的CD133+细胞,近左后肢皮下接种分选的CD133-细胞;A、B、C组右侧分别接种1×102个、1×103个、1×104个CD133+细胞,左侧分别接种1×104个、1×105、1×106个CD133-细胞,观察8周。第二部分基因表达谱分析人体肺腺癌干细胞与正常肺干细胞的差异基因表达1.流式细胞术分选干细胞:将制备的单细胞悬液用CD133-PE和CD326-FITC双标记,用空白管和同型对照管设分选区域,分选下来的细胞留少部分荧光显微镜观察,其余用于表达谱芯片检测;2.表达谱芯片检测:将分选的细胞提取总RNA,逆转录,Cy3标记,杂交,荧光扫描,软件分析差异基因的表达;3.差异表达谱的分析:对差异表达的基因进行GO和pathway分析,对分析结果分类总结,重点分析原癌基因改变、wnt信号通路改变;4. q RT-PCR验证芯片结果:挑选表达上调的Rab25、TLE2和表达下调的FGR、MACF1进行qRT-PCR,比较qRT-PCR法和表达谱芯片法中各基因的改变倍数,进行t检验。第三部分人体肺腺癌干细胞特异性标志的筛选和鉴定1.候选靶位Rab25、TLE2、LRP5和PYGO2的生物信息学分析:通过查询NCBI GENBANK、SWISSPROT/TrEMBL、GO、KEGG、Blastp、Protscale等数据库,分析候选靶位分子的m RNA长度、蛋白长度、染色体定位、分子量、GO分类、信号通路、疏水区、同源序列等信息。2. Rab25在肺腺癌和正常肺干细胞中的表达:通过候选靶位蛋白的生物信息学分析,我们选择Rab25作为肺腺癌干细胞的特异性靶位(Rab25属于RAS超家族成员,具有小GTPase活性),通过CD133-PE和Rab25(二抗为FITC标记)双标法检测Rab25在肺腺癌组织和正常肺组织干细胞中的表达;3.Rab25单抗对肺腺癌干细胞增殖能力的影响:在肺腺癌干细胞增殖实验中加入不同浓度的Rab25抗体,检测干细胞增殖活性。结果第一部分人体肺腺癌干细胞的分离和鉴定:1.肺腺癌和正常肺组织干细胞的分布:组织中有少量干细胞,正常组织中分布于BADJ(支气管肺泡连接处),腺癌组织中分布于肺泡壁和BADJ。2.干细胞的分离:分离到的干细胞纯度在60%-70%,荧光显微镜具有典型干细胞形态。3.肺腺癌干细胞的培养:培养第6天细胞呈团,第20天可见典型细胞球。4.肺腺癌干细胞增殖实验:细胞增殖明显,增殖能力强。5.成瘤实验:1×104个CD133+细胞组一只小鼠成瘤,其余组未成瘤。第二部分基因表达谱分析人体肺腺癌干细胞与正常肺干细胞的差异基因表达1.流式细胞术分选干细胞:正常组织中CD133+CD326+双阳性细胞的比例为0.31%,共分选了约5×107个细胞,得到双阳性细胞约1×105个;肺癌组织中CD133+CD326+双阳性细胞的比例为0.65%,共分选了约7×107个细胞,得到双阳性细胞约4×105个。2.表达谱芯片检测:提取的RNA经甲醛变性凝胶电泳显示无降解,纯度高,标记后肺腺癌干细胞和正常肺干细胞的特异性活性分别为21.8和26.9pmolCy3/μgcRNA,标记产物总量分别为13.98和13.9μg;应用Agilent4×44K人全基因组芯片进行杂交分析,LCSC与LSC的差异表达基因为5798个(cut-off值为2.0)。3.差异表达谱的分析:基因分层聚类显示两种干细胞具有明显不同的表达谱。GO分析显示在生物过程中,生物调节相关的差异表达基因占41%,其他比例较高的涉及细胞组分形成和发生、胞内信号级联放大、细胞分化、细胞周期等基因。在分子功能中,我们发现,72%的差异表达基因与结合有关,主要为蛋白结合(45%)、核酸结合(15%)、ATP结合(10%)和钙离子结合(6%)等。其他比例较高的包括转移酶活性、激酶活性和酶调节活性。在细胞组分方面,包膜占13%,其他为非膜结合细胞器、胞外区、细胞组分、大分子复合物成分。Pathway分析显示wnt信号通路差异显著(p<0.01),在差异表达的基因中共有13个参与wnt通路信号转导,原癌基因分析显示共有11个原癌基因的表达发生了差异性改变。4. q RT-PCR验证芯片结果:FGR表达下调7.2倍,RAB25上调20倍,TLE2表达上调15倍,MACF1下调1.8倍。表达谱芯片和q RT-PCR两组数据进行t检验,p>0.05,两种方法无显著差异。第三部分人体肺腺癌干细胞特异性标志的筛选和鉴定1.候选靶位Rab25、TLE2、LRP5和PYGO2的生物信息学分析:通过查询NCBI GENBANK、SWISSROT/TrEMBL、GO、KEGG、Blastp、Protscale等数据库,我们得到了候选抗原的m RNA长度、蛋白长度、染色体定位、分子量、GO分类、信号通路、疏水区、同源序列等信息。2.免疫荧光鉴定Rab25在组织切片中肺腺癌干细胞的特异性表达:肺腺癌切片中可见明显双阳性细胞胞膜为黄色,胞浆部分绿色,证实Rab25在肺腺癌干细胞胞膜和胞浆均表达,主要表达在胞膜;正常肺组织干细胞胞膜红色,胞浆不着色,表明其基本不表达Rab25。3. Rab25对肺腺癌干细胞增殖的影响: Rab25抗体可明显抑制肺腺癌干细胞的增殖(p<0.05),抑制效应与浓度呈量效关系。结论1.肺腺癌和正常肺组织存在少量干细胞,正常组织中分布于BADJ处,腺癌组织中分布于肺泡壁和BADJ。2.分离的肺腺癌干细胞具有较强的增殖能力和致瘤能力。3.肺正常组织中干细胞比例为0.31%,肺腺癌组织中干细胞比例为0.65%。4.基因分层聚类显示两种干细胞具有明显不同的表达谱。在生物过程中,生物调节相关的差异表达基因占41%;在分子功能中,结合相关的差异表达基因占72%,细胞组分中包膜占13%。wnt信号通路差异显著,在差异表达的基因中共有13个参与wnt通路信号转导,原癌基因中11个发生差异性改变。5. Rab25在肺腺癌干细胞中特异性表达,正常肺干细胞基本不表达。6. Rab25单抗可明显抑制肺腺癌干细胞的增殖,抑制效应与浓度呈量效关系。