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背景:膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤,据美国国家肿瘤中心统计,2008年膀胱癌的新发病例为68810例,死亡14100例,每年需花费约29亿美元用于治疗膀胱肿瘤。对于进展性膀胱癌患者,尽管采用包括手术、放化疗在内的综合措施,患者五年生存率只有20–40%。目前分子病理学研究认为膀胱肿瘤是一种多基因异常的疾病,通过一种或多种癌基因和/或癌基因表达失调导使细胞逃避了正常生长调控机制,出现自主增殖、侵袭增加、微血管形成等。微小RNA (microRNA或miRNA)是近年来发现的长度约21—25bp的非蛋白编码RNA,通过与靶基因mRNA的3非编码区(3’UTR)结合,在转录后水平促进靶基因mRNA降解和/或抑制其翻译而发挥类似于小干扰RNA的基因沉默作用。已有研究证明超过50%的microRNA定位在癌相关基因区域或在脆弱区域,这使人们有理由相信microRNA与肿瘤生成有关。近年来表达谱研究证实microRNA在肝癌、肺癌、乳腺癌及结肠癌等多种肿瘤中表达异常,microRNA可能扮演着癌基因或抑癌基因的角色。然而在膀胱癌中,对microRNA的表达和功能了解还不多。目的:从microRNA表达芯片出发,寻找在膀胱癌中差异表达的microRNA,应用实时定量RT-PCR在扩大的样本群中加以验证,进而探索部分差异表达的microRNA在膀胱肿瘤细胞系中的功能。方法:1. microRNA表达芯片筛选和验证:收集手术切除的膀胱癌标本和相应的癌旁对照共3对,以mirVana microRNA提取试剂盒提取总RNA,应用Cy3标记RNA,Agilent microRNA表达芯片进行杂交,经孵育,洗脱后扫描,Feature Extraction软件读取数据并分析,结果以肿瘤组织∶瘤旁组织表达差异倍数表示。进一步选取表达阳性率高的microRNA通过Cluster 3.0软件构建聚类分析。采用实时定量RT-PCR法对芯片筛查出的部分差异表达的microRNA(miR-143,miR-145,miR-125b,miR-200c和miR-141)进行验证,验证样本量为20例肿瘤和6例正常膀胱粘膜组织。以TRIzol提取总RNA,基因特异性茎环形逆转录引物进行逆转录反应。逆转录后应用taqman探针法进行相对定量研究,以RNU6B为内参,计算microRNA相对表达强度,结果以均数±标准差表示。以student t检验比较不同组织中microRNA表达差异,p<0.05有统计学差异。2. microRNA 125b功能研究:实时定量RT-PCR检测膀胱肿瘤细胞系J82,T24,EJ中miR-125b的表达,在T24细胞中通过瞬时转染miR-125b及其反义抑制物观察细胞增殖和集落形成的改变,通过半定量RT-PCR检测其靶基因ERBB2之mRNA水平改变,通过western blot检测其蛋白水平变化。3. microRNA 21功能研究:在膀胱肿瘤细胞系T24中通过瞬时转染miR-21及其反义抑制物观察细胞增殖和集落形成的改变,以MTT法检测转染后细胞对细胞毒性药物多柔比星IC50的改变,通过细胞核染色法观察对多柔比星诱导的细胞凋亡的影响,通过western blot检测抗凋亡蛋白BCL2表打变化。4. microRNA 221功能研究:northern blot法检测膀胱肿瘤细胞系T24、RT4和永生化的正常尿路上皮细胞SV-HUC-1中miR-221的表达,在T24细胞中转染miR-221反义寡核苷酸抑制物,流式细胞术观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导的细胞凋亡和细胞周期改变,化学发光法检测TRAIL诱导的caspase3活性变化,western blot检测靶分子p27kip1的表达改变。结果:1.通过microRNA芯片筛查发现肿瘤中上调3倍以上的microRNA包括miR-141、miR-200c、miR-96、miR-182、miR-183等,下调3倍以上的包括miR-125b,miR143、miR-145、miR-99a、miR-100等。实时定量RT-PCR验证发现miR-125b,miR143、miR-145在肿瘤组织中明显下调,miR-143和miR-145表达存在高度相关性。2. miR-125b在膀胱肿瘤细胞中表达较低,尤其是T24和EJ细胞。T24细胞中转染人工合成的miR-125b mimics可以有效达到miR-125b过表达,而转染miR-125b反义寡核苷酸抑制物可以进一步抑制其表达。T24细胞转染miR-125b mimics后48小时、72小时、96小时增值抑制率分别为15.9%、25.0%、18.8%。转染miR-125b mimics后T24细胞集落形成受抑制。转染miR-125b mimics可以在mRNA和蛋白水平抑制ERBB2表达,而转染miR-125b反义寡核苷酸抑制物可以上调其表达水平。3. T24细胞中转染miR-21 mimics和对照序列相比细胞增殖无明显差异;转染miR-21反义抑制剂和对照序列相比,48、72、96小时细胞增殖活力显著受抑制。T24细胞中转染miR-21 mimics及其对照,多柔比星IC50值分别为3.89±0.80μg/mL和1.67±0.29μg/mL,p=0.011;转染miR-21反义抑制剂及其对照,多柔比星IC50值分别为1.30±0.04μg/mL和2.85±0.58μg/mL,p=0.010。T24细胞中转染miR-21 mimics后与对照相比阿霉素诱导的细胞凋亡减少,BCL2蛋白表达上调反之,抑制T24细胞中miR-21,阿霉素诱导的细胞凋亡增加,BCL2蛋白表达下调。4. miR-221的表达在T24、EJ细胞中显著高于正常尿路上皮细胞。T24细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡不敏感,但抑制miR-221可增加T24细胞对TRAIL诱导细胞凋亡的敏感性,并上调细胞周期素依赖的蛋白激酶抑制剂p27kip1表达。T24细胞中抑制miR-221提高TRAIL诱导后caspase 3活性。结论:1.膀胱癌中存在多种microRNA表达异常,包括miR-143,miR-145,miR-125b等。2. miR-125b可体外抑制膀胱癌细胞系T24增殖和集落形成,抑制ERBB2表达。3.抑制miR-21可体外抑制膀胱癌细胞系T24增殖,并可能通过BCL2相关通路增加多柔比星诱导的细胞凋亡,从而增加T24细胞对多柔比星的敏感性。4.抑制miR-221可增加膀胱肿瘤T24细胞对TRAIL诱导细胞凋亡的敏感性,并增加其靶点p27kip1蛋白表达。这些结果提示microRNA参与膀胱肿瘤发生、发展的许多过程,并可能成为有效的干预靶点。