DNA是生命的物质基础,编码着自然界千变万化的遗传现象,贮存着生物界无穷无尽的遗传信息。众所周知,DNA分子由A、T、C、G四种核苷酸经3’,5’-磷酸二酯键相连构成DNA的基本骨架。但在基本骨架之外,DNA还存在修饰,构成对DNA结构的重要补充,其中同样蕴涵神秘的遗传学信息。DNA修饰( DNA modification)是指与DNA共价结合的修饰基团,其结果是使具有相同序列的等位基因处于不同的修饰状态,其分子基础是DNA甲基化以及染色质的化学修饰和物理重塑。DNA修饰与蛋白修饰、非编码RNA调控共同构成了表观遗传中基因表达调控的3个层面,共同在遗传因素和环境因素的互动关系中起着桥梁的作用。DNA修饰按来源主要分为两大类:DNA自发性化学修饰和外来因素引发的修饰。“DNA甲基化限制修饰系统”是最常见的DNA自发性化学修饰,也是DNA修饰研究领域的第一项重大发现。DNA甲基化可能存在于所有生物中,在真核生物基因组中主要发生在CpG和CpXpG的胞嘧啶碱基5位碳环上,简称5’-mC,原核生物基因组中CCA/TGG和GATC则常被甲基化。DNA甲基化是表观遗传学中研究最为深入的一种形式,具有多方面的生物学意义,与胚胎正常发育、基因表达调控、雌性个体X染色体失活、寄生DNA序列的抑制、印迹基因及基因组的结构稳定等关系密切。特别是近几年研究发现,该机制的异化可导致基因表达的异常及基因组稳定性的降低,继而促进肿瘤发生和发展。除了DNA自发性化学修饰,外环境中的理化因素也能作用于细胞内DNA,对DNA的结构和稳定性产生影响,导致碱基修饰和加合物形成,这就是另一类DNA修饰。若这些DNA分子上的修饰逃脱了生物体内的修复或被不正确的修复,则将导致遗传信息的改变而诱发变异。所以,DNA加合物的形成可能是产生DNA突变的第一阶段,继而发生DNA链断裂、碱基置换和碱基缺失等一系列事件。很多研究已经证明,环境中多种诱变剂或其活性产物能与DNA结合形成加合物,引发DNA损伤或基因结构的异常,由此造成的重要相关基因表达或功能上的改变是细胞恶性转化的主要前提。随着现代分子生物学技术和理论的发展,人们正在不断的发展并完善灵敏的技术来检测化学物与DNA的作用,以使DNA甲基化、DNA加合物及DNA双链断裂(Double Strand Break,DSB)等DNA分子异常修饰与疾病发生和遗传变异的关系更明朗的展现在人类面前。本研究的目的是建立DNA甲基化和DNA加合物这两种DNA修饰的检测方法。在第一部分中,我们用亚硫酸氢钠测序法成功鉴定了人肿瘤细胞株HepG2和MCF-7的RASSF1 A和E-cadherin基因启动子甲基化状态,同时,针对亚硫酸氢钠处理后的DNA进行PCR扩增出现大量非特异性扩增产物,扩增效率很低等缺点,对原有方法中的PCR扩增方法加以改进,使之更有利于DNA甲基化的检测,也为PCR扩增CG含量较高的启动子区域提供了参考方法。另外,已知的加合物检测方法仅能检测特定基因片段中的DNA加合物,对全基因组加结合物尚无法达到检测的目的,鉴于此,我们建立了一种检测基因组中DNA加合物的新方法,实验证实该方法合理可行,有望成为一种高通量且快速有效地检测基因组DNA加合物位点的新技术。第一部分改进的亚硫酸氢钠测序法在启动子CpG岛甲基化检测中的应用目的:用亚硫酸氢钠测序法检测启动子CpG岛甲基化状态,改进其PCR扩增过程,并检验改进后方法在甲基化检测中的可行性。方法:人肿瘤细胞株HepG2和MCF-7基因组DNA经亚硫酸氢钠化学修饰后;针对RASSF1A和E-cadherin基因启动子DNA序列分别设计特异性引物,用常规、降落、及改进PCR分别扩增,比较扩增效果,PCR产物纯化回收后,T-A克隆入载体pGEM-T ,转化大肠杆菌(E . coli DH5α),经PCR扩增鉴定后获得阳性克隆,测序比对。结果: HepG2细胞中RASSF1A基因启动子扩增产物直接测序结果显示,所测365个碱基对应的原始序列中含胞嘧啶(C)113个,其中15个CG位点均未转变,mCpG/CpG为100%,序列起始部位还有4个C未转变,其余94个C全部转变为T,转化率为95.92%,实验结果再次证明HepG2细胞RASSF1A基因启动子是高甲基化的,同时证明亚硫酸氢钠化学修饰完全、结果可信。MCF-7细胞扩增产物克隆测序显示,RASSF1A基因启动子17个CG中有16个CG未转变为TG,mCpG/CpG为94.2%,其余还有3个CTG和1个CAG未转变; E-cadherin基因启动子共有37个CG,其中有32个转变为TG,其余5个保持CG不变,mCpG/CpG为13.5%,其余碱基中还有3个CTG和3个CAG未转变为TTG和TAG。比较三种PCR扩增效果,发现用改进后的PCR可可扩增出理想目的条带,用降落PCR和常规PCR方法,也有目的条带出现,但亮度明显减弱,且引物二聚体和非特异性扩增产物明显。结论: HepG2细胞基因组DNA中RASSF1-A启动子是高甲基化的; MCF-7细胞基因组DNA中,RASSF1A基因启动子CpG岛是高甲基化的,而E-cadherin基因启动子CpG岛未呈现高甲基化状态;改进后的PCR与常规、降落PCR相比,提高了扩增效率,抑制了非特异性扩增,增强了以PCR为基础的甲基化分析的可行性,更为扩增CG含量较高的启动子区域提供了参考。第二部分用LMPCR检测基因组DNA加合物的方法学研究目的:基于LMPCR技术,建立一种检测基因组加合物的新方法。方法:盐酸氮芥处理人肝瘤HepG2细胞形成的加合物,制备基因组DNA片段、LMPCR检测。具体策略如下:首先,提取基因组DNA经XbaI内切酶切割,得到的DNA片段与人工合成的连接子Linker3连接, PCR检测连接效果。其次,上述连接产物经碱性磷酸酶(CIAP )去磷酸化处理消除已有磷酸末端,处理产物经哌啶剪切及变性后,在加合物位点处断裂形成带有5’磷酸基末端的DNA单链。再用单个引物Primer3在Taq酶的作用下将DNA单链延伸成带有A尾的粘端双链结构。再次,粘端双链经T4 DNA连接酶与5’端为T、带有磷酸基团的连接子Linker1连接,亲和素包裹的磁珠捕获连接产物。以该连接产物为模板,生物素标记Primer1和Primer3为引物扩增。最后,PCR产物经磁珠纯化、MmeⅠ内切酶切割后与人工合成的连接子Linker2连接,以该连接产物为模板, Primer1、Primer2为引物扩增包含有加合物相邻基因的DNA片段。结果:①盐酸氮芥给药浓度与HepG2细胞存活率呈负相关(R2=0.957,P<0.01),依照标准曲线,确定HepG2存活率为90%的盐酸氮芥处理浓度为0.45mmol/L;②终浓度为0.45mmol/L的盐酸氮芥处理HepG2,基因组DNA完整性好,无断裂可见断裂,可用与下一步的检测;③用XbaI酶切后的DNA与连接子Linker3的连接产物经PCR扩增,产物电泳显示应为长短不一的DNA条带,长度主要集中在200bp～1000bp,与预期结果一致,制备基因组DNA片断成功。③LMPCR扩增产物长度为70bp,得到基因组中DNA加合物位点相邻序列,LMPCR检测基因组DNA加合物成功。结论:新的加合物检测方法能够对全基因组中加合物做到定性检测;并且具有创新性、通用型、简便性和安全性,有望成为一种高通量且快速、有效检测基因组DNA加合物位点的新技术。