研究背景：胃癌(Gastric cancer, GC)患者早期其症状无一定特异性,近一半的胃癌患者在就诊时病情已进展到晚期。虽然胃癌相关的治疗进展较快,但该疾病预后仍较差。目前科学家研究表明细胞因子在胃癌的发生发展中起了一定作用,尤其是转化生长因子家族,其中转化生长因子(transform ing growth factor,TGF))-p是其中的一个重要组成部分。TGF-β是一种目前发现的较新的细胞因子,具有广泛的生物学活性。目前的研究表明,TGF-β产生的丁细胞已被证明是在抗肿瘤免疫反应的研究的一个重要因素。胃癌的发病机制实际上受多种因素的影响,其机制与免疫系统的发展有关。除了常见的癌细胞和基质细胞的固有影响,也包括肿瘤微环境使得胃癌形成免疫细胞。在过去的十年,胃癌的诊断和治疗研究发现,虽然患者较过去有相对较长的生存时间,但相对于其他疾病,胃癌的高转移率影响了胃癌患者更长生存时间。到目前为止,对胃癌的临床病理特点,肿瘤组织学类型、淋巴结转移研究仍然有限,且有相当大的争议。常用的胃癌诊断方法,虽然有病理诊断、物理诊断(影像诊断)、肿瘤相关标志物的血清学检查及其他先进的诊断方法,但是这些方法或操作是复杂的,昂贵的,或需要执行的操作对身体常常造成损害。研究证实胃癌疾病发生发展乃至转移由多因素,包括遗传、肿瘤抑制基因、癌基因、生长因子、细胞粘附分子多因素相互作用而成的。因此,研究分析并寻找胃癌发生发展分子机制在目前胃癌的治疗中具有重要的临床价值。以往研究表明,在胃癌研究中发现TGF-β产生T细胞以抑制抗肿瘤免疫反应,提示TGF-β在胃癌免疫逃避监视中是一个重要的因素。虽然TGF-β免疫逃逸机制目前还不清楚,但是有研究已经表明TGF-β免疫逃逸与人类白细胞抗原(HLA-G)有关。通过计算机分析HLA-G3’-UTR等位基因,HLA-G,miR-152变化对于预测microRNA的等位基因有一定作用[8-10]。我们研究发现胃癌患者HLA-G水平与TGF-β呈正相关。此外,miR-152在TGF-β诱导调节作用的实验中发现与肿瘤免疫逃逸有一定关系。实验研究表明在胃癌中miR-152可能有抑制HLA-G过度表达作用。miR-152可以导致增加NK细胞介导的细胞溶解,表明miR-152可能有作为免疫系统增强剂的功能。不过尚未探明miR-152如何在胃癌细胞HLA-G表达改变的机制,也未探明miR-152如何在TGF-β诱导的免疫逃逸机制中与HLA-G关系。基于以上问题尚未解决,因此,我们进行实验研究探讨HLA-G水平是否受miR-152在胃癌细胞中表达的影响,miR-152与TGF-β、HLA-G关系以及研究潜在的TGF-β诱导的肿瘤免疫逃逸机制。本研究是从肿瘤免疫学以及细胞分子生物学角度去探索它们之间新的分子机制,具有重要科研临床意义。具有下面我们分两部分进行探讨。首先我们采用酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assays)技术检测了我们在医院收集的20例胃癌患者术前留外周血样中TGF-β的表达水平,并与人白细胞抗原-G(HLA-G)做了相关分析。结果发现,TGF-β在胃癌组织中显著高表达,其水平与外周血中的HLA-G水平高度相关。然后,我们对TGF-β进行了获得性和失活性功能研究,结果表明,TGF-β能在实验中能上调HLA-G的mRNA水平和蛋白水平。另一方面,生物信息学分析表明TGF-β与miR-152之间存在相互作用关系,提示miR-152可能会参与HLA-G的表达调节。我们的研究数据提示,在一定环境与刺激下胃癌组织中miR-152的表达发生了一定的变化,结果显示miR-152的表达与TGF-β的表达呈负性相关。我们的体外细胞实验证实miR-152对胃癌细胞的HLA-G表达存在负性调节作用,突变实验研究表明TGF-β的过表达能够消除miR-152诱导的HLA-G 3’UTR活性降低。因此,我们认为：高表达的胃癌TGF-β有可能通过抑制miR-152来上调HLA-G表达从而参与胃癌的免疫逃逸。不仅如此,本研究也表明了将TGF-β用于胃癌免疫治疗以改善患者的预后、提高生存率的潜在可能性。第一部分TGF-β诱导胃癌细胞HLA-G表达机制的研究研究目的研究TGF-β诱导胃癌细胞HLA-G的表达及可能作用机制。研究方法通过临床工作获取山东大学齐鲁医院20例胃癌患者胃癌组织及癌旁组织标本,同时采集术前1天相应患者的外周血标本。所有患者术前检查均未发现其他脏器肿瘤病变,均接受根治性胃癌切除手术,术前均未接受针对肿瘤的放疗、化疗及免疫治疗,所有肿瘤标本均经术后病理证实。经医院伦理委员会批准,所有纳入实验的胃癌患者均在术前签署病情及实验知情同意书。1.研究数据来源：临床资料：选取2012年9月至2013年7月在山东大学齐鲁医院胃肠外科病区住院治疗的胃癌患者。收集选取符合条件的胃癌患者(15男性,5例女性)。实验分组见正文。诊断以及分期按照国际分类标准(TNM)。2.组织标本以及特殊器械准备我们在胃癌患者手术后就收集肿瘤组织和癌旁组织进行冷冻保存,之后常规使用石蜡包埋,福尔马林液固定所取肿瘤切片。制作成标本以用于做PCR技术分离以及后续操作。从这些病人中术前1天收集外周血样,为将来使用应用EDTA血浆进行制备。组织以及血样需立即冻结在-80。液氮环境下。EDTA血浆或细胞培养上清液。通过使用TGF-β kit以及sHLA-G试剂盒测定TGF-β水平与可溶性HLA-G浓度。3.组织病理学制备通过手术后就收集的肿瘤组织和以及癌旁组织在-80。液氮冷冻保存,做病理学制备时取出新鲜胃癌组织后立即放入在10%福尔马林溶液中固定2-3天后按标准病理学所需程序进行洗涤,浸腊,包埋以及防脱片的制作,切片与制片等常规程序。4.相应外周血标本中可溶性HLA-G (sHLA-G)浓度检测将患者的外周血标本用乙二胺四乙酸(EDTA)血浆做处理后存放入-80℃液氮罐冷冻备用。使用预先准备好的sHLA-G试剂盒并按说明书使用检测外周血中可溶性HLA-G的浓度计算统计结果。5.通过ELISA对TGF-p和HLA-G的检测操作前准备：操作前首先根据预实验选定较适合的酶标抗体稀释度。用PBS液稀释特异性抗体或免疫球蛋白部分,配置捕获抗体溶液(最终浓度为0.2-10 μ g/m1)。确定待测抗体浓度所需的捕获抗体和结合物的浓度,用PBS液配置此浓度的捕获抗体溶液。在室温下收集胃癌患者细胞上清并按照人类白细胞抗原(HLA-G) ELISA试剂盒说明书,各试剂在使用前平衡至室温。包被：包被后需要PBS液充分洗涤滴定板各包被孔等。然后封闭。再洗涤。稀释标准抗原。加样。温育。最后洗涤：洗涤的次数掌握在为3-4次。加酶标抗体：接着在常温下在各反应孔中加入预先备好的酶标抗体化学发光辣根过氧化物酶底物约0.1ml,在37℃温度下孵育2小时,然后再常温下小心洗涤。对于临床外周血样本,预先EDTA抗凝处理后,按照ELISA试剂盒说明,进行TGF-β和HLA-G水平检测。之后显色。显色后终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。结果判断：在三次重复该试验后得出结果。按照制造商要求将试剂应用ELISA Kit以及sHLA-G试剂盒进行测定。也应用比色法计算结果判断(酶标仪检测OD值).吸收测定：TGF-β水平以及HLA-G浓度可应用TGF-β ELISA kit以及sHLA-G kit根据不同浓度用来检测其量的变化。6应用TGF-β kit、sHLA-Gkit检测胃癌细胞TGF-β与HLA-G的浓度。在经培养BGC823和SGC7901细胞株配制不同浓度TGF-β,然后在不同浓度TGF-β(2.5,5或10ng/ml)24或48小时处理后检测上清液HLA-G的表达水平,应用TGF-βkit、sHLA-G kit检测胃癌细胞TGF-β与HLA-G的浓度。结果见图2。7.统计分析所得数据以均数±标准差(X±SD)表示。用Pearson’s correlation法进行相关分析。单因素方差分析或χ2检验法分析组间的差异。用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析。P<0.05被认为差异有显著统计学意义。研究结果1.在实验中对TGF-β及HLA-G的浓度进行了分析,发现通过皮尔森的回归分析出一个强烈的正相关关系(R2=0.5455；P<0.001)。2.ELISA实验分析表明TGF-β处理后48小时,HLA-G水平增高(*P<0.05**P<0.01)。3.实验发现随着TGF-β逐步升高的浓度和处理时间的增加,结果显示,HLA-G表达逐渐上调。结论：1.在胃癌细胞以及组织中TGF-β及HLA-G呈高表达水平,统计学分析显示两者的表达呈相关性。2.在胃癌中不同浓度TGF-β刺激能上调HLA-G不同程度表达。TGF-β表达和HLA-G的表达在胃癌组织中及外周血中的浓度呈显著正相关。3.TGF-β参与了胃癌组织中HLA-G的表达上调说明TGF-β和HLA-G在胃癌组织及外周血中的蛋白水平呈正相关；进一步阐明TGF-β不仅与胃癌的活化和转移相关,而且在普通外科领域可能成为判断胃癌患者预后的指标之一应用于临床实践。第二部分通过抑制miR-152研究TGF-β在胃癌免疫逃逸作用及机制研究目的：通过抑制胃癌细胞miR-152研究TGF-β及HLA-G之间的关系,进一步探讨胃癌TGF-β参与肿瘤免疫逃逸可能作用及机制。研究方法：在进行实验前首先对待检测细胞进行细胞复苏,细胞消化等处理,达到一定要求方可进行细胞培养以及下一步操作1.常规细胞复苏以及细胞培养,传代首先在液氮储存罐中小心取出SGC7901和MGC823细胞株冻存试管,按照细胞复苏程序待细胞复苏后放入37℃水浴中,所备用的两种人胃癌细胞株SGC7901和MGC-823用含10%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)和抗生素(1%链霉素/青霉素)的RMPI-1640培养液培养,通常培养在37℃、含5% CO2的饱和湿度恒温培养箱中。然后取出细胞。然后在仪器中进行离心,离心之后弃去上层液注意保留底层细胞并慢慢再加入培养液,之后在准备好的培养皿继续进行接种。需要注意的是需要等待培养的细胞密度较高时才传代。用于我们实验的细胞需是复苏后的第三代细胞。2.细胞转染,质粒转染等待细胞复苏后常温下小心将SGC7901细胞系和BGC-823细胞系以1x105/ml密度种至六孔板,并分别给予不同浓度TGF-β刺激(浓度分别为2.5 ng/ml, 5 ng/ml或l0ng/ml),并在24h或48h后进行检测细胞中HLA-G mRNA表达和细胞上清中HLA-G表达。主要方法采取阳离子脂质体法进行转染。细胞转染约70%时在Opti-MEM介质(Invitrogen)用脂质体2000 (Invitrogen)汇合。我们经检索选定在Kpnl和Xhol酶切位点(Invitrogen方法)使用PCR技术片段在常温下克隆到荧光素酶基因载体以备用。然后使用定点诱变法对miR-152结合位点进行定点突变诱导从而构建Mut-HLA-G质粒,构建后备用。所有用于转染的质粒载体经扩增后由DNA Midiprep kit提取。siRNAs及对照siRNA(si-NC)购买于Invitrogen公司。孵育24小时后,将在Opti-MEM培养液中将miR-152 mimics、inhibitor miR-152的高表达质粒和干扰质粒分别转染入胃癌细胞中。3.荧光素酶检测在萤光素酶检测前首先在常温下使用PGL3载体构建含有HLA-G 3’UTR的萤光素酶报告质粒。引物见正文。将PGL3-HLA-G和PRL-TK荧光素酶经转染后与miR-152 mimics, miR-152 inhibitor以及relative negative control RNA共转染,进行荧光素酶分析。在常温下以上分子共转染24小时后,然后应用双荧光素酶报告1000分析系统检测萤光素酶活性。所有的实验都进行至少三次以论证结果。4.RNA分离,qRT-PCR以检测HLA-G mRNA和TGF-β在本实验中我们采用Trizol法提取胃癌细胞中的总RNA,为了检测HLA-G mRNA和TGF-β,按产品说明书使用SuperScript III Reverse Transcriptase将oligo-dT primers标定的RNA反转录入cDNA,在本实验中经对比以及检索我们最终选用磷酸甘油酸脱氢酶(GAPDH)作为内参。为了检测成熟的miR-152,用mirVana miRNA Isolation kit提取小RNA,用小核RNA U6作为内参。然后在实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)中,ABI 7300 SYBR预混料应用ExTaq酶来作为中介。之后按照Takara公司的ABI 7300实时荧光定量试剂盒进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测以及整理结果,统计并分析。采用比较阈值法对实验数据进行相对定量分析。5.分别对不同浓度以及时间的TGF-β及HLA-G浓度检测以及miR-152表达的检测.用ELISA法检测转染后细胞株培养上清液,使用TGF-βELISA kit检测不同浓度的TGF-β,采用s HLA-G仪器检测可溶性HLA-G的浓度。然后检测miR-152浓度并分析之间关系。6统计分析以上所统计结果我们所得数据以均数±标准差(X±SD)表示来进行。单因素方差分析或χ2检验法分析组间的差异。用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析。P<0.05被认为差异有显著统计学意义。研究结果1.经应用不同浓度TGF-β(2.5,5或10ng/ml) 24h刺激下,发现同时HLA-G mRNA表达不同程度上升(图2B)。2.经实验在TGF-β高表达的细胞和干扰细胞株中检测到了不同浓度的miR-152。而在试管(体外)中TGF-B能诱导miR-152显著下调(P<0.01；图3),说明在胃癌细胞TGF-β可能抑制miR-152。3.在转染48h后观察,抑制的miR-152与HLA-G有较一致上升趋势,这说明在胃癌BGC823和SGC7901细胞株中miR-152改变并调节了HLA-G的表达(图4G)。4.通过比较分析不同浓度miR-152和不同浓度的TGF-β对HLA-G表达的调节作用。结果显示：miR-152下调HLA-G,TGF-β上调HLA-G(如图4)。经过细胞转染24 h后,从荧光素酶检测结果显示HLA-G3’非翻译区呈现负调节(图4c),同时观察到M ut-HLA-G 3’UTR没有明显的规律(图4E、F)。5.经处理应用不同的miR-152 mimics,miR-152 inhibitor以及negative controlRNA与miR-152 mimics control不同水平检测发现抑制miR-152可以向上调节HLA-G表达,同时抑制TGF-β诱导HLA-G表达的改变(’P<0.05,”P<0.01)。6.经过检测发现,在上调TGF-β浓度时,加入miR-152 mimics后则部分下调,间接说明HLA-G表达与miR-152成反比例关系(图7A、B)(’P<0.05,”P<0.01)。作线形图发现HLA-G浓度与miR-152成反比例关系(R2=0.5267；P<0.001)。同时TGF-β浓度与miR-152成反比例关系(R2=0.5944；P<0.001)结论1.研究发现不同浓度的胃癌细胞TGF-β刺激可产生不同浓度的miR-152,反之亦然,说明两者之间有交互影响。2.通过分析以上结果可以发现通过抑制miR-152可促进胃癌细胞TGF-β的表达。实验中发现在胃癌组织miR-152表达水平与TGF-β表现成反比。3.HLA-G表达和miR-152浓度之间存在显著负性相关。在本实验中发现胃癌细胞株中miR-152呈低表达；实验表明具有统计学差异。4.结果显示抑制miR-152转录活性后,胃癌细胞中TGF-β可以诱导HLA-G的表达。这对胃癌细胞的活化起着重要作用并对进一步研究胃癌TGF-β免疫逃逸机制有重要的意义。意义：经以上研究发现通过抑制miR-152转录活性可以增加胃癌TGF-β和HLA-G表达水平,该发现可能揭示胃癌TGF-β免疫逃逸机制。本次实验在国内外已发表的实验以及临床研究中未见有报道。本实验揭示miR-152通过抑制胃癌TGF-β诱导HLA-G表达的新机制。本研究也从miRNA层次揭示与TGF-βp,HLA-G之间关系,对于远期寻找治疗胃癌新靶点、新的生物技术具有重要的理论以及临床意义。