阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种以认知功能障碍为主要临床表现的进行性中枢神经系统(central nervous system, CNS)退行性疾病,是痴呆的最常见类型。β-淀粉样蛋白(amyloid β peptide, Aβ)沉积在脑实质引起CNS损伤是AD的特征性病理改变。越来越多的研究表明,除引起CNS损伤外,Aβ沉积在脑微血管壁引起内皮细胞损伤、血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)功能障碍也是AD的重要病理改变,然而AD中BBB损伤的机制尚不清楚。研究认为Ap沉积在脑血管系统,破坏BBB结构完整性,BBB屏障功能损伤及脑血流(cerebral blood flow, CBF)减少,脑组织氧和营养不足,脑内毒性代谢产物堆积,从而加速AD病变进展。鉴于BBB在AD发病中的重要作用,本课题拟从BBB病变入手,研究Ap损伤BBB的可能机制,并通过观察银杏叶提取物(extract of ginkgo biloba, EGb)对该损伤途径的干预影响,以期为探索AD的防治手段提供实验依据。BBB是机体的重要屏障之一,对维持脑内环境稳定、保证大脑正常功能极为重要。脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMEC)是BBB的基本骨架,具有区别于外周血管内皮的独有特征。在高度分化的神经血管系统中,BMEC以其显著的特异性在BBB屏障特性及物质转运功能中发挥着重要作用。BBB屏障功能及其低渗性主要依赖于内皮间紧密连接(tight junction, TJ),后者是BBB屏障功能的重要结构基础,在保持内皮生理屏障和低通透性方面具有关键作用。因此各种原因引起的TJ破坏都将导致BBB损伤,继而CNS内环境紊乱,最终加速中枢病变进展。TJ主要由相关铰链蛋白ZO (ZO-1、2、3)、 Claudin (Claudin-1、3、5、12)、Occludin构成。BBB结构完整性与TJ正常组合开放及关闭有关,TJ蛋白表达减少或蛋白分布异常均能引起TJ结构改变,导致BBB结构完整性破坏,BBB通透性增加。尸检研究证实AD患者存在BBB结构完整性受损,TJ蛋白水平显著减少。在体动物及体外细胞研究也发现Ap可引起TJ蛋白水平下降,BBB通透性增加。晚期糖化终产物受体(receptor for advanced glycation end-products, RAGE)是晚期糖化终产物(advanced glycation end-products, AGEs)的一种特征性细胞表面受体,属于免疫球蛋白超家族成员。健康成人中,除在肺组织以外,RAGE仅有极微量表达。RAGE除与AGEs结合外,还能与高速泳动族盒蛋白-1 (high mobility group box 1, HMGB-1)、S100/钙粒蛋白家族、Aβ等多种配体结合调节细胞生命活动。近年研究发现,在CNS, Aβ通过RAGE下游信号通路激活氧化应激、炎症反应等损伤途径,从而活化小胶质细胞炎症效应,损伤神经元。Aβ-RAGE相互作用还能激活核因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB),引起RAGE表达增加,从而激活A8介导的正反馈损伤效应。可见,脑内RAGE表达上调与AD神经元损伤相关。此外,BMEC上极微量表达的RAGE是参与BBB转运Aβ的重要载体之一,其与低密度脂蛋白受体相关蛋白-1 (LDH receptor related protein, LRP-1)协同维持脑内Ap正常水平。LRP-1将脑内Ap转运至外周血液循环,继而经肝脏代谢清除,RAGE则将血液中Aβ转运入脑沉积。在AD中,LRP-1表达减少,RAGE含量显著增加。然而,RAGE在AD BBB损伤中的作用仍不十分清楚。据此,本研究提出猜想,RAGE是否也与Ap诱导BBB损伤过程有关,其相关调控机制如何?研究表明,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)与多种病变引起的BBB通透性增加有关,而抑制MMP活性能阻断BBB损伤途径。如脑卒中动物模型ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白水平降低,敲除MMP-9能改善上述TJ蛋白水平。置于脉冲电磁场(pulsed electromagnetic field, PEMF)中的小鼠脑血管内皮细胞MMP-2、MMP-9表达增加,ZO-1水平明显减少,BBB通透性增加,而抑制MMP-2、MMP-9活性可阻断PEMF引起的BBB损伤。据此我们推测,AD中BBB损伤可能与Aβ诱导MMP表达有关,后者通过酶降解作用引起TJ蛋白含量减少,引起TJ正常结构破坏及BBB通透性增加。AD属于中医“神病”、“健忘”等范畴。课题组在前期研究基础上提出痰和瘀在AD发病中具有重要作用,并指出化瘀法是中药防治AD的重要原则之一。课题组前期研究还发现,EGb能改善改善老年患者认知功能,患者简易精神状态检查量表(mine-mental state examination, MMSE)、画钟试验(clock drawing, CD)、记忆商及短时记忆分值都显著增加。EGb是中药银杏的干燥叶提取物,具有活血化瘀通络之功效,是目前临床防治AD的常用药物之一。EGb能改善老年痴呆患者学习记忆功能,并具有清除活性氧自由基、改善线粒体功能、抑制Aβ神经毒性等作用。最近一项关于EGb对BMEC保护作用的研究发现,EGb能显著改善氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation, OGD)诱导的BMEC细胞活力下降,并能抑制OGD诱导的RAGE表达。据此本研究观察了EGb对Aβ诱导BBB损伤的影响,并探索其机制是否可能与EGb抑制RAGE表达有关。因此,本课题采用小鼠BMEC单培养方式建立BBB细胞模型,观察Aβ1-42对BBB的影响并探讨RAGE在Aβ1-42介导BBB损伤中的作用及其可能机制,同时观察EGb对Aβ1-42诱导BBB损伤的干预作用。本课题主要结果如下：(一)RAGE介导Aβ1-42损伤BBB的机制研究1.Ap1-42诱导BMEC细胞损伤Apl-42诱导BMEC细胞损伤：MTT结果显示Ap1-42降低BMEC细胞活力。三种形态Aβ1-42中,Aβ1-42单体(Aβ1-42-monomer, Aβ1-42-Mono)、寡聚态Aβ1-42 (Aβ1-42-oligomer, Aβ1-42-Oligo)及纤维状Aβ1-42 (Aβ1-42-fibrils, Aβ1-42-Fibril)均能降低BMEC细胞活力。Aβ1-42-Oligo细胞毒性较Aβ1-42-Mono与Aβ1-42-Fibril显著,Aβ1-42-Oligo呈时间依赖性和浓度依赖性诱导BMEC细胞活力下降。2.Aβ1-42诱导BBB细胞模型通透性增加Ap1-42诱导BBB模型通透性增加：通过BMEC单培养方式建立BBB细胞模式,检测荧光素钠(sodium fluorescein, Na-F, MW: 376 Da)吸光值分析BBB细胞模型通透性变化,结果显示三种成分Ap1-42均可诱导BBB模型通透性增加,Aβ1-42-Mono组Na-F吸光值为对照组的4.3倍,Aβ1-42-Oligo组Na-F吸光值为对照组的8.2倍,Aβ1-42-Fibril组Na-F吸光值为对照组的1.7倍；Aβ1-42-Oligo呈时间依赖性和浓度依赖性诱导单细胞层BBB模型通透性增加。3.Aβ1-42诱导TJ蛋白水平下降1)Aβ1-42诱导ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白水平下降：Western Blot免疫印迹结果显示,Aβ1-42-Oligo及Aβ1-42-Fibril均能不同程度降低ZO-1、Claudin-5、Occludin水平,其中与Aβ1-42-Mono和Aβ1-42-Fibril相比,Aβ1-42-Oligo的作用最显著。2) Aβ1-42-Olig时间和浓度依赖性诱导ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白水平下降：Western Blot免疫印迹结果显示,Aβ1-42-Oligo时间依赖性和浓度依赖性降低ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白水平。4.Aβ1-42诱导RAGE表达增加1)Aβ1-42上调RAGE蛋白水平：Western Blot免疫印迹结果显示,Aβ1-42-Mono、Aβ1-42-Oligo及Aβ1-42-Fib均能不同程度诱导BBB内皮细胞RAGE蛋白水平增加,其中Aβ1-42-Olig的作用最显著。2) Aβ1-42-Oligo时间和浓度依赖性上调RAGE蛋白水平：Western Blot免疫印迹结果显示,Aβ1-42-Oligo时间依赖性和浓度依赖性上调RAGE蛋白水平。3) Aβ1-42-Oligo上调RAGE mRNA表达：RT-PCR结果显示,Aβ1-42-Olig上调内皮细胞RAGE mRNA表达。5.Aβ1-42诱导MMP-2、MMP-9表达增加1) Aβ1-42-Oligo诱导MMP-2、MMP-9蛋白水平增加：Western Blot免疫印迹显示,Aβ1-42-Oligo诱导内皮细胞MMP-2、MMP-9蛋白水平增加。2) Aβ1-42-Oligo上调MMP-2、MMP-9 mRNA表达：RT-PCR结果显示,Aβ1-42-Oligo上调内皮细胞MMP-2、MMP-9 mRNA表达。6.抑制RAGE活性阻断TJ蛋白水平下降及RAGE、MMP-2与MMP-9表达1)抑制RAGE活性阻断Aβ1-42-Oligo诱导的RAGE表达及TJ蛋白水平减少：Western Blot免疫印迹显示,中和抗体neutralizing anti-RAGE对ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白水平无影响,但能抑制Aβ1-42-Oligo引起的ZO-1、Claudin-5、Occludin水平降低及RAGE表达增加。2)抑制RAGE活性阻断Aβ1-42-Oligo诱导的MMP-2、MMP-9表达：WesternBlot免疫印迹显示,中和抗体neutralizing anti-RAGE对MMP-2、MMP-9表达无影响,Aβ1-42-Oligo诱导MMP-2、MMP-9蛋白水平增加效应被中和抗体neutralizing anti-RAGE阻断。(二) EGb干预Aβ1-42-Oligo诱导BBB损伤的研究1.EGb抑制Aβ1-42-Oligo诱导BMEC细胞损伤EGb改善BMEC细胞活力：通过MTT检测细胞活力,结果显示,EGb浓度依赖性抑制Aβ1-42-Oligo引起的BMEC细胞活力的降低,EGb浓度为100μg/ml时BMEC细胞活力为对照组的97.01%,EGb浓度200 μg/ml时BMEC细胞活力为对照组的95.13%。2.EGb抑制Aβ1-42-Oligo诱导BMEC细胞凋亡EGb抑制细胞凋亡发生：Hoechst-33258染色显示EGb抑制Aβ1-42-Oligo诱导的细胞凋亡发生,降低Aβ1-42-Oligo引起的BMEC细胞凋亡比例。3.EGb抑制Aβ1-42-Oligo诱导BMEC细胞内ROS生成EGb抑制细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成：H2DCF-DA荧光染色检测细胞内ROS水平,结果显示EGb抑制Aβ1-42-Oligo诱导的BMEC胞内ROS生成。4.EGb抑制Aβ1-42-Oligo诱导BBB细胞模型通透性增加EGb抑制ApM2-Oligo诱导的BBB通透性增加：Na-F检测单细胞层BBB模型通透性结果显示,EGb浓度依赖性抑制Aβ1-42-Oligo诱导的BBB通透性增加。5.EGb抑制Aβ1-42-Oligo诱导TJ蛋白水平降低EGb改善ZO-K Claudin-5、Occludin蛋白水平Western Blot免疫印迹结果显示EGb浓度依赖性抑制Aβ1-42-Oligo诱导的BMEC上ZO-1、Claudin-5、 Occludin蛋白水平降低。6.EGb抑制Aβ1-42-Oligo诱导RAGE水平增加EGb抑制RAGE蛋白水平增加Western Blot免疫印迹,结果显示EGb浓度依赖性抑制Aβ1-42-Oligo诱导的BMEC上RAGE水平增加。结论：1)Aβ能引起BBB细胞模型通透性增加,Aβ-Oligo可能是AD中引起该损伤效应的主要Ap成分。2) RAGE是介导Aβ损伤BBB的重要环节,Aβ-RAGE相互作用引起TJ蛋白损伤,BBB细胞模型通透性增加,其机制与诱导BMEC损伤及上调MMP-2、MMP-9及RAGE自身表达增加相关。3)EGb对Aβ诱导BBB损伤具有保护作用,能保护TJ蛋白,降低BBB细胞模型通透性,其机制与抑制Aβ毒性诱导BMEC损伤及抑制RAGE表达相关。通过比较三种不同成分Aβ对BBB的影响,本研究首次阐述AP1-42-Oligo可能是AD中引起BBB损伤的主要因素,并揭示RAGE是Aβl-42诱导BBB损伤过程的重要环节,其机制与RAGE介导Aβ细胞毒性,激活RAGE下游信号途径,引起MMP-2与MMP-9表达相关。本研究首次阐明EGb抑制Aβ1-42-Oligo诱导的BBB损伤,其保护机制与EGb改善细胞活力、抑制细胞凋亡与内源性ROS生成,以及抑制RAGE表达有关。本研究为探讨RAGE作为AD的治疗靶点,以及EGb防治AD的机制研究提供了科学的实验基础。