金花茶(Camellia nitidissima Chi.)属于山茶科(Theaceae)山茶属,灌木状多年生木本植物,以蜡质的黄色花朵而闻名,是稀有的园林观花植物。除观赏价值外,金花茶在人们生活中,尤其是食品、药用、保健品等工业中有着重要的作用,但其自然繁殖率低,而采用组织培养技术可以加速繁殖速度,且有利于种质保存以及其他的方面研究。本试验以金花茶成年材料离体再生体系为材料来源,获得同步化体胚材料,克隆了金花茶体胚PPO基因,采用实时荧光定量PCR技术对金花茶体胚发生过程中PPO基因表达变化进行了研究,并测定了金花茶体胚发生过程中PPO酶活性的变化。此外,对金花茶体胚发生过程中POD、APX进行活性和同工酶变化进行了分析。主要研究结果如下:1.金花茶同步化体胚材料获得以金花茶体胚为材料,进行同步化体胚筛选。结果表明:在添加山梨醇的MS培养基上,体胚生长色泽形态良好,球形胚和子叶胚能够获得同步化材料,心形胚和成熟胚则采用培养和挑选手段结合获得同步化材料,离体苗和花状子叶胚在培养基上能够保持良好的生长状况。分别以金花茶子叶胚切块和成年植株叶片为材料,进行愈伤组织培养的研究。结果表明:金花茶子叶胚去外表皮后切块,接种于MS+1.5 mg·L-12,4-D+0.5mg·L-1KT能诱导出愈伤组织,并能较好的继代,蔗糖浓度为6%时,愈伤组织生长良好。金花茶成年叶片以流水中冲洗30min,75%的酒精浸泡30s后,转入0.2%HgCl2消毒剂浸泡8min方法消毒后,接种于MS+1.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IAA+4 mg·L-1 NAA,愈伤诱导率为98.335%,遮光有助于叶片愈伤组织的生长。2金花茶体胚PPO基因克隆以金花茶球形胚为材料,在已知得山茶属植物PPO基因序列上设计引物,进行巢式PCR,经过引物筛选得到1800bp左右的特异条带。该目的片段经测序得到的长为1788bp,该序列与登录Genbank山茶属其他植物PPO基因序列进行核苷酸比对发现,同源性74%左右;经分析后发现金花茶体胚PPO基因编码595个氨基酸,与登录Genbank山茶属其他植物PPO基因序列进行氨基酸序列比对,同源性为72%左右。3.金花茶体胚发生过程中PPO基因实时荧光定量表达分析本研究以18S rRNA作为内参基因,利用实时荧光定量PCR技术分析了金花茶体胚发生过程中PPO基因表达变化。结果表明:金花茶体胚发生过程中PPO基因表达量呈下降趋势,球形胚PPO基因表达量最大;子叶胚和心形胚次之,成熟胚最小;而正常子叶胚和花状多子叶胚的表达量存在明显差异。4.金花茶体胚发生过程中PPO活性变化分析对金花茶体胚发生过程中PPO活性变化规律进行研究。结果表明:在金花茶体胚发育过程PPO活性明显比较低,变化趋势与PPO基因定量表达结果相似。5.金花茶体胚发生过程中相关酶变化研究对金花茶体胚发生过程中各个阶段的培养物相关酶活性变化规律进行研究。结果表明:在金花茶体胚发育过程中POD酶活性呈先升高后下降趋势;APX酶活性整体比较高,呈“M”型趋势。对金花茶体胚发生过程中各个阶段的培养物进行POD、APX同工酶变化进行研究,结果表明:在金花茶体胚发生过程中,POD同工酶酶谱既有酶带强弱的差异,又有带数的增减较多;APX同工酶具有稳定性,不同阶段之间APX同工酶酶谱有酶带强弱变化。