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目的:1、探讨PA的T3SS结构对糖尿病溃疡创面组织中自噬相关蛋白表达的影响,并进一步探讨其对糖尿病溃疡创面愈合的影响。2、探讨PA的T3SS分泌的毒力蛋白ExoU、ExoS分别对糖尿病溃疡创面组织中自噬相关蛋白表达的影响,并进一步探讨其对糖尿病溃疡创面愈合的影响。3、探讨雷帕霉素及庆大霉素对PA感染的糖尿病溃疡创面组织中自噬相关蛋白表达的影响及对糖尿病溃疡创面愈合的影响。方法:一、第一部分:36只SD大鼠随机分为六组:糖尿病非感染组(DM+未感染),糖尿病感染PAK组(DM+PAK),糖尿病感染PAK△pcrV-(DM+PAK△pcrV-),非糖尿病非感染组(N+未感染),非糖尿病感染PAK组(N+PAK),非糖尿病感染PAK△pcrV-(N+PAK△pcrV-),每组各6只。分别在造模第0天、3天、7天、14天、21天观察创面愈合情况并进行创面内菌落计数;分别在造模第0、7、14天取创面组织,HE染色观察各组大鼠创面组织内细胞形态、结构变化;免疫组化及Western blotting检测各组大鼠创面组织内自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、p62的表达;免疫荧光双染色检测各组大鼠创面组织内巨噬细胞中LC3的表达;二、第二部分:24只SD大鼠随机分为四组:糖尿病感染PA103组(DM+PA103),糖尿病感染PA01(DM+PA01),非糖尿病感染PA103组(N+PA103),非糖尿病感染PA01(N+PA01),每组各6只。方法同第一部分;三、第三部分:36只SD大鼠随机分为六组:糖尿病感染PA103组(DM+PA103),糖尿病感染PA103且雷帕霉素干预组(DM+PA103+雷帕霉素),非糖尿病感染PA103组(N+PA103),非糖尿病感染PA103且雷帕霉素干预组(N+PA103+雷帕霉素),糖尿病感染PA103且庆大霉素干预组(DM+PA103+庆大霉素),非糖尿病感染PA103且庆大霉素干预组(N+PA103+庆大霉素),每组各6只。方法同第一部分。结果:一、第一部分:1、创面愈合情况:与非糖尿病组大鼠相比,糖尿病组大鼠第3天有黑痂形成,第7天有较多脓性分泌物,创面未见缩小,第21天创面仍未愈合,伤愈合时间明显延迟。在糖尿病组中,与DM+未感染及DM+PAK△pcrV-相比,第3天DM+PAK组黑痂形成、坏死较严重、周围较红肿,第7天有脓性分泌物渗出且最多,第21天仍有较多分泌物,第21伤口直径较大。2、创面内菌落计数:与非糖尿病感染组相比,糖尿病感染组菌落增长速度较快且减少速度较慢,其中与DM+PAK△pcrV-相比,DM+PAK组第7天以后菌落数开始减少,但减少不明显。3、HE结果:糖尿病感染组在第7、14天炎性粒细胞浸润逐渐增加,与DM+PAK△pcrV-相比,DM+PAK分别在第7、14天有更多炎性细胞浸润。非糖尿病组感染组在第7天炎性细胞浸润达到高峰,第14天炎性细胞下降,与N+PAK△pcrV-组相比,N+PAK分别在第7、14天有更多炎性细胞浸润。4、免疫组化结果:各组LC3、Beclin-1在第0、7、14天表达递增,p62蛋白第7、14天表达均逐渐下降(P均<0.05)。N+非感染组LC3、Beclin-1表达在第7、14天表达明显高于DM+非感染组,p62表达在第7、14天低于DM+非感染组(P均<0.05)。DM+PAK△pcrV-组LC3、Beclin-1表达在第14天高于DM+PAK,p62表达在第14天低于DM+PAK(P均<0.05);N+PAK△pcrV-组中LC3、Beclin-1表达在第7、14天高于N+PAK,p62表达在第7、14天低于N+PAK(P均<0.05);与N+PAK组相比,DM+PAK组在第14天LC3、Beclin-1表达较低,p62表达较高(P均<0.05);与N+PAK△pcrV-组相比,DM+PAK组LC3、Beclin-1表达在第7、14天较低,p62表达在第7、14天较高(P均<0.05)。5、免疫印迹结果:同免疫组化结果相一致。6、免疫荧光结果:DM+PAK△pcrV-组巨噬细胞中LC3表达在第14天高于DM+PAK组;N+PAK△pcrV-组中巨噬细胞中LC3表达在第7、14天高于N+PAK。二、第二部分:1、创面愈合情况:与DM+PA01相比,DM+103组第3天有黑痂形成、坏死较严重、周围较红肿,伤口直径扩大,第14天伤口直径仍未缩小,坏死仍严重,第21天仍有较多分泌物,创面仍未愈合。2、创面内菌落计数:DM+PA103和DM+PA01在第0-7天持续增长,与DM+PA01相比,DM+PA103增加较快,第7天以后菌落数开始减少,减少较缓慢。3、HE结果:与DM+PA01组相比,DM+PA103分别在第7、14天有较多中性粒细胞、巨噬细胞浸润。4、免疫组化结果:各组LC3、Beclin-1在第0、7、14天表达递增,p62蛋白第7、14天表达均逐渐下降(P均<0.05)。DM+PA103组LC3、Beclin-1表达在第14天低于DM+PA01,p62表达在第14天高于DM+PA01(P均<0.05);N+PA103组LC3、Beclin-1表达在第7天低于N+PA01,p62表达在第7天高于N+PA01(P均<0.05);与N+103组相比,DM+103组LC3、Beclin-1表达在第7、14天较低,p62表达在第7、14天较高(P均<0.05)。5、免疫印迹结果:同免疫组化结果。6、免疫荧光结果:DM+103组巨噬细胞中LC3表达在第14天低于DM+PA01;N+PA01组巨噬细胞中LC3表达在第7天高于N+PA103。三、第三部分:1、创面愈合情况:与DM+PA103相比,DM+PA103+雷帕霉素在第7天脓性分泌物较前减少,第14天创面直径明显缩小。DM+PA103+庆大霉素组在第7天创面直径明显缩小,第21天伤口趋于愈合。与N+PA103相比,N+PA103+雷帕霉素在第3天组织破溃较轻,脓性分泌物渗出较少,第7天创面直径明显缩小,第21天创面基本愈合。N+PA103+庆大霉素组第3天结痂较轻,第21天创面基本愈合。2、创面内菌落计数:DM+PA103和DM+PA103+雷帕霉素在第0-7天持续增长,与DM+PA103组相比,DM+PA103+雷帕霉素增加较慢,第7天以后菌落数减少较快,DM+PA103+庆大霉素组第7天菌落数减少较快;与N+PA103组相比,N+PA103+雷帕霉素在第3天后菌落明显减少,N+PA103+庆大霉素第3天后菌落明显减少(P<0.05)。3、HE结果:与DM+PA103组相比,DM+PA103+雷帕霉素与DM+PA103+庆大霉素组分别在第7、14天中性粒细胞、巨噬细胞浸润等炎症细胞数目较少。与N+PA103组相比,N+PA103+雷帕霉素与N+PA103+庆大霉素分别在第7、14天炎症细胞浸润减少。4、免疫组化结果:各组LC3、Beclin-1在第0、7、14天表达递增,p62蛋白第7、14天表达均逐渐下降(P均<0.05)。DM+PA103+雷帕霉素组LC3表达在第7、14天高于DM+PA103,Beclin-1表达在第14天高于DM+PA103,p62表达在7、14低于N+PA103(P均<0.05);N+PA103+雷帕霉素组LC3在第7、14天高于DM+PA103,Beclin-1表达在第7天高于N+PA103,p62表达在第7天低于N+PA103(P均<0.05);与DM+PA103+雷帕霉素组相比,N+PA103+雷帕霉素组LC3、Beclin-1表达在第7、14天较高,p62表达在第7、14天较高(P均<0.05)。DM+PA103+庆大霉素组和DM+PA103组在各个时间点Beclin-1、LC3、p62的表达量均无显著差异,N+PA103+庆大霉素组与N+PA103组在各个时间点Beclin-1、LC3、p62的表达量均无显著差异(P均>0.05)。5、免疫印迹结果:同免疫组化。6、免疫荧光结果:DM+PA103+雷帕霉素组巨噬细胞中LC3表达在第7、14天高于DM+PA103;N+PA103+雷帕霉素组巨噬细胞中LC3在第7、14天高于N+PA103。结论:1、在创面愈合过程中,非糖尿病及糖尿病大鼠创面组织中细胞自噬蛋白水平均增强,但是糖尿病组的自噬水平明显低于非糖尿病组,且糖尿病创面炎症持续,创面愈合延迟。2、在糖尿病感染创面中,PA的T3SS均可抑制自噬蛋白水平的表达,自噬对细菌的清除能力减弱,PA的T3SS分泌的毒力蛋白ExoU抑制自噬蛋白水平的表达更明显,自噬对细菌的清除能力明显减弱,ExoU可导致糖尿病创面坏死更严重,感染持续且糖尿病创面愈合受损。3、在非糖尿病感染创面和糖尿病感染创面中,雷帕霉素可通过增强自噬促进对PA的清除可加速创面愈合,但其在糖尿病状态的效果弱于非糖尿病状态。4、庆大霉素在感染病创面可有效地清除PA以减少感染,进而促进创愈合,无论在糖尿病创面还是非糖尿创面,庆大霉素对创面内自噬蛋白水平无明显影响。