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目的构建用于评价去甲基化表观遗传污染物健康损害风险的真核表达载体。方法经过大肠杆菌扩增后大量提取pEGFP-C3质粒;对pEGFP-C3质粒进行双酶切,胶回收目的双酶切短片段;并对其中EGFP基因启动子区DNA片段实施定向甲基化处理。随后将其与双酶切长片段回复连接成环,胶回收重组质粒,双酶切验证重组质粒的高甲基化状态。将甲基化处理重组pEGFP-C3质粒转染进HepG-2细胞,以5-AZA为阳性去甲基化毒物与转染细胞共培养,通过亚硫酸氢钠测序法定量检测EGFP基因启动子区甲基化状态,通过实时定量PCR定量检测EGFP基因表达,借助流式细胞术和荧光定量摄片定量检测共培养细胞的绿色荧光强度,在DNA甲基化、EGFP基因mRNA表达、GFP蛋白等多个层次研究5-AZA染毒处理与其去甲基化能力的响应关系。结果双酶切和亚硫酸氢钠测序结果表明pEGFP-C3质粒GFP基因启动子区处于高甲基化状态。高甲基化pEGFP-C3质粒成功转染进入HepG2肝癌细胞株,并在DNA甲基化、EGFP基因mRNA表达、GFP蛋白多个层次对EGFP基因表达情况进行了成功的检测。当5-AZA的染毒梯度为0.0016,0.008,0.004,0.2uM时,其染毒量与基因启动子区甲基化水平,EGFP基因mRNA表达、GFP蛋白荧光强度均呈现良好的线性关系。C3质粒EGFP基因启动子区甲基化水平与5-AZA处理浓度存在线性相关,线性方程为y = -0.1962x + 0.856;R2 = 0.800。EGFP表达相对量和5-AZA剂量梯度成良好的剂量效应关系,y = 1.359Ln(x) + 8.0869,R2 = 0.6569。细胞GFP荧光强度均数与5-AZA存在良好的剂量效应线性关系,线性方程为y = 10.402x + 6.0334;R2 = 0.829。结论成功构建了高甲基化的绿色荧光蛋白的报道基因载体,并且其在真核细胞内的绿色荧光蛋白基因表达与阳性受试去甲基化污染物存在比较灵敏的响应关系。敏感、稳定的高甲基化pEGFP-C3质粒载体为研究污染物去甲基化表观遗传毒性评价方法奠定了坚实基础。