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脂类水解酶是一种能够催化酯类化合物水解和合成的一类酶,广泛应用于食品、洗涤剂、材料合成等领域。米根霉来源的脂类水解酶具有良好的1、3位置专一性和立体选择性,在酯类物质制备、生物柴油生产及手性物质的合成中具有很高的应用价值。本研究从米根霉中克隆出12个脂类水解酶基因,并对其进行了生物信息学分析;实现了其中6个基因在毕赤酵母中的分泌表达,对重组酶进行了初步的酶学性质研究;并对其中两个重组酶进行了纯化和详细的酶学性质研究。主要研究结果如下:1、以米根霉基因组DNA或cDNA为模板,共克隆出12个具有完整开放读码框的米根霉脂类水解酶基因,其所编码的蛋白氨基酸数目为210～502,与NCBI数据库中已知脂类水解酶的最高一致性范围为35～100%。2、将以上12个基因分别构建毕赤酵母的pPICZa-C表达载体,并将其电转入毕赤酵母X33中进行诱导和酶活测定;其中基因rol-428、rol-9852、rol-9898、rol-14195、rol-14186和rol-9910能够成功表达;对这6个重组酶的粗酶性质进行测定,结果如下:其最适作用底物分别为pNPC16、pNPC10、pNPC4、pNPC8、pNPC8、pNPC8,最适反应pH为7.5～9.5,最适反应温度为20～40℃,在0℃均具有一定的酶活力;在这6个重组酶中,rRol-9852的酶活最高,其次是rRol-9898。3、大量诱导重组酶rRol-9852,并对其进行分离纯化和酶学性质研究。结果如下:rRol-9852的最适作用底物为pNPC1o,比活为451.82 U/mg;最适反应pH为7.5,最适反应温度为20℃,在0℃时仍有23%左右的酶活力,在pH6.0～9.0和温度≤45℃时较稳定;在最适条件下,rRol-9852对底物pNPC10的Km为0.375 mmol/L,Vmax为560.54 μmol/(mg.min),且低浓度的甲醇、丙三醇、Li+、Ag+、Ca2+、Ni2+、EDTA 对其具有一定的激活作用。4、大量诱导重组酶rRol-9898,并对其进行分离纯化和酶学性质研究。结果如下:rRol-9898的最适作用底物为pNPC4,比活为117.90U/mg;最适反应pH为8.0,最适反应温度为20℃,在0℃时仍有25%左右的酶活力,在pH6.0～8.0和温度≤35℃时较稳定;在最适条件下,rRol-9898对底物pNPC4的Km为1 mmol/L,Vmax为357.14μmol/(mg·min),且对低浓度的丙醇、丙酮、丙三醇、Li+、Ag+、K+、Ca2+、Ni2+、Cu2+、EDTA具有一定的抗性。本课题从米根霉中克隆出12个脂类水解酶基因,并在毕赤酵母中实现其中6个基因的表达,初步性质研究表明这6个重组酶的酶学性质具有较大的差异。该研究可为米根霉脂类水解酶的深入研究及其后续的工业应用奠定基础。