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目的:原儿茶醛(PCA),是从中药丹参中提取的一种水溶性单体,具有较强的抗缺氧能力,和扩张冠状动脉,增加冠血流量的疗效。本实验拟选取适宜的培养条件及操作方法,成功从SD大鼠心脏中分离出纯度高、生物活性好的CSCs,研究不同浓度PCA对大鼠CSCs体外增殖作用的影响,以及PCA促进CSCs体外增殖,与Pi3k-Akt信号通路调控细胞周期进程的关系,为后续实验提供理论依据。方法:选用1-3日龄的SD大鼠,酶消化的方法分离培养出心肌干细胞,第二代CSCs与不同浓度的PCA(0.16mM,0.42mM,1.26mM,3.78mM和11.34mM)共培养,24h,48h,72h后用MTT比色法检测PC A对CSCs的影响;不同浓度的PCA(0.42mM,1.26mM,3.78mM)与CSCs共培养24h,C-kit荧光抗体标记,流式细胞仪测定c-kit+的干细胞的比率,最终确定出PCA的最佳给药剂量和时间;通过C-kit荧光抗体标记,流式细胞仪分选的方法,进一步提高c-kit+CSCs的比率,选取纯化后的第二代CSCs,用C-kit和K i-67荧光抗体分别标记细胞膜和细胞核,免疫荧光鉴定的方法检测c-kit+CSCs的纯化;PCA与纯化后的CSCs共培养24h,流式细胞术分析细胞周期不同阶段所含CSCs的比率;RT-qPCR法检测细胞周期进程相关基因的表达,即Pi3k,Akt,C yclinD,CDK4,Ki-67,PCNA的mRNA的表达水平,以及干细胞相关基因C-kit和Sca-1的mRNA的表达;进一步采用Western Blot免疫印迹实验考察基因Pi3k,Akt1和PCNA蛋白表达水平。结果:经过消化分离的心脏组织,3d之后,成纤维样细胞逐渐从组织块儿的边缘逸出,并逐渐相互交联形成细胞层。1周后,可见一些小、圆、亮的细胞附着在成纤维细胞层上。收集纤维层上小细胞,经过传代培养,细胞呈现出棒状梭型,且形态均一,延长细胞生长时间,cscs聚集交融,逐渐形成类似于太阳形状的集落。mtt法检测表明,与对照组相比,pca作用后的cscs生长增殖迅速,24h后,当pca的浓度为0.16mm,0.42mm,1.26mm,3.78mm和11.34mm时,cscs增殖具有统计学意义(p<0.05orp<0.01),48h的检测结果与24h的相似,72h后,当pca的浓度为0.42mm,1.26mm,3.78mm时,cscs增殖具有统计学意义(p<0.05orp<0.01),但是,随着时间的延长,cscs的增殖程度降低。流式细胞术检测显示,0.42mm,1.26mm和3.78mm的pca与细胞培养24h后,c-kit+cscs比率达到19.6%,41.0%和17.6%,与空白组6.9%相比,差异具有统计学意义(p<0.01)。细胞周期分析的结果显示,在s期,0.42mm,1.26mm和3.78mm作用过的cscs的细胞比率分别为10.27±2.61%,22.44±2.77%和9.00±2.56%,与对照组5.11±2.89%相比,具有统计学差异(p<0.05orp<0.01);在g2/m期,0.42mm,1.26mm和3.78mm作用过的cscs的细胞比率分别为8.72±2.57%,2.56±1.88%和7.34±2.87%,与对照组5.54±2.61%相比,0.42mm和3.78mm组具有统计学差异(p<0.05),1.26mm组细胞比率显著低于对照组;在g0/g1期,0.42mm,1.26mm和3.78mm作用过的cscs的细胞比率分别为81.07±3.39%,73.99±3.00%和83.67±3.21%,与对照组89.35±3.22%相比,差异具有统计学意义(p<0.05orp<0.01)。rt-qpcr结果显示,1.26mm组的pi3k的表达水平,以及0.42mm,1.26mm,3.78mm组的akt、cyclind、cdk4的表达水平,与空白组cscs相比显著上调(p<0.05orp<0.01);1.26mm组的sca-1的表达水平,和3.78mm组的pcna的表达水平,以及0.42mm,1.26mm,3.78mm组的c-kit及ki-67的表达水平,与空白组cscs相比显著上调(p<0.05orp<0.01)。westernblot免疫印迹结果显示,0.42mm,1.26mm,3.78mm的pca作用于cscs后,pi3k蛋白和pcna蛋白的表达水平显著上调(p<0.05orp<0.01),akt1蛋白的表达水平,在0.42mM和1.26mM的PCA组显著上调(P<0.05 or P<0.01),但是在3.78mM的PCA作用下,Akt1蛋白的表达水平下调。结论:在新生的SD大鼠心肌组织中,存在有C-kit+CSCs,且CSCs在体外能够自我更新和分裂增殖;PCA可促进CSCs的体外增殖;PCA可上调Pi3k,Akt,CyclinD,CDK4,C-kit,Sca-1,Ki-67和PCNA(细胞增殖相关蛋白和干细胞特性相关蛋白)的基因或蛋白的表达,表明PCA能够维持心肌干细胞的特性,其促进CSCs体外增殖的作用与Pi3k-Akt信号通路调控细胞周期进程有关。