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内含肽(Intein)是存在于蛋白翻译产物(前体蛋白)阅读框架内的一段氨基酸序列,在前体蛋白转变为成熟蛋白的过程中,通过反式剪接,内含肽被剪切释放出来,游离于成熟蛋白之外,而内含肽两侧的外蛋白子(外显肽)通过肽键连接成成熟的天然肽。该过程不需要特定的细胞环境以及辅助因子的参与,甚至可以在体外进行。内含肽因其独特的剪接功能在蛋白质工程、基因诊断和治疗、转基因植物研究等领域有着广阔的应用前景。来自解淀粉芽胞杆菌的Barnase蛋白属于细胞毒蛋白,广泛用于植物雄性不育、无籽果实、植物抗病性提高等方面的研究。研究表明,内含肽介导的蛋白剪接过程中,内含肽类型、内含肽与外显肽(extein)剪接位点的氨基酸序列变化对剪接效率影响很大。因此,本研究选用两种天然断裂型内含肽Ssp DnaE和Npu DnaE,以Barnase细胞毒蛋白为拆分对象,研究不同内含肽之间、杂合内含肽以及拆分位点处氨基酸变化对反式剪接效率的影响,从而为上述内含肽在Barnase蛋白以及其他功能蛋白的拆分以及功能重建方面的研究提供参考。本研究将Bamase蛋白拆分为N端和C端外显肽(拆分处氨基酸不同)并分别与Ssp DnaE和Npu DnaE断裂型内含肽的N端和C端融合构建融合基因。N端和C端融合基因之间组成不同的组合(16个组合),分别从原核细胞、原核蛋白表达、真核细胞表达三个方面对其反式剪接效率进行了研究。获得的主要研究结果如下：1.利用原核细胞共表达分析了内含肽介导的反式剪接功能将Ssp DnaE内含肽基因、Npu DnaE内含肽基因N端和C端分别与分拆后的Bamase蛋白N端和C端连接,获得了四对基因：SN基因和SC基因、SNG基因和SCG基因、SNZ基因和SCZ基因、NN基因和NC基因(融合基因均为本实验室按甘蓝密码子偏好性合成保存)。将所有N端融合基因插入原核表达载体pETDuet-1,获得抗氨苄青霉素的表达载体；所有的C端融合基因插入原核表达载体pACYCDuet-1,获得抗氯霉素的表达载体。然后将N端融合基因表达载体与C端融合基因表达载体组成不同的组合(共计16种组合)共转化大肠杆菌BL21,通过大肠杆菌菌落的生长检测内含肽能否成功介导分拆后的Barnase毒蛋白反式剪接。双抗性平板(Amp+Cm)共转化结果分为三种：(1)无菌落生长。包括NN+NC、 NN+SC、NN+SCG三个组合。(2)平板上能长双抗菌落,但菌落中质粒表现不稳定。这类组合又分为两类,一类是平板能长少量菌落,但质粒不稳定,包括SN+NC和SNZ+NC两个组合；一类是平板能长大量菌落,但质粒不稳定,包括SNG+NC、 SN+SCZ、SNG+SCZ、SNZ+SCZ、NN+SCZ五个组合。(3)平板上能长大量双抗菌落,且菌落中的质粒表现稳定。包括SN+SC、SNG+SC、SNZ+SC、SN+SCG、 SNG+SCG、SNZ+SCG六个组合。原核细胞表达的结果表明Npu DnaE内含肽本身能介导分拆后的Barnase蛋白高效剪接,同时Npu DnaE内含肽的N端与Ssp DnaE内含肽C端之间也能高效剪接；Ssp DnaE内含肽的剪接效率低,N端内含肽和C端内含肽均为Ssp DnaE内含肽时不能实现有效剪接。C端外显肽第一个氨基酸为Ser或Cys对Npu DnaE内含肽的N端剪接效率无影响；C端融合基因外显肽第一个氨基酸为Cys,对Ssp DnaE内含肽剪接效率的提高有帮助；添加源自于Ssp DnaE内含肽原始外显肽氨基酸残基KFAEY和CFNKS有利于剪接反应的发生但该添加对NN基因的剪接效率有影响。2.在蛋白质水平验证内含肽介导的被拆分的Bamase毒蛋白N端和C端的反式剪接将Barnase蛋白N端第11位氨基酸由Ala突变成为Gly, Barnase蛋白C端第102位的His突变为Arg,使突变后的Bamase蛋白失去了毒性功能,便于在大肠杆菌中表达。将N端融合基因(Bamase N+intein N)和C端融合基因(intein C+Barnase C)组成不同组合插入pETDuet-1的不同表达框之间获得蛋白共表达载体,转入大肠杆菌中表达,SDS-PAGE电泳分析蛋白大小和剪接情况。结果表明：(1)N端和C端蛋白能表达且能反式剪接并有目标蛋白Bamase的生成,包括pETNNm-NCm、pETNNm-SCGm、pETNNm-SCZm、 pETSNZm-SCZm、pETSNm-SCZm五个双基因表达载体,与原核细胞表达结果相一致。(2)N端和C端蛋白能表达但未有目标蛋白Bamase的生成,包括pETSNm-SCm、pETSNm-SCGm、pETSNGm-SCGm、pETSNGm-SCm、 pETSNGm-SCZm pETSNZm-SCm、pETSNZm-SCGm、pETSNm-NCm、 pETSNGm-NCm, pETSNZm-NCm十个双基因表达载体,部分载体因剪接效率低下或两端蛋白表达不平衡,其蛋白表达与原核细胞表达结果不完全一致。(3)N端或C端蛋白缺少表达,pETNNm-SCm双基因表达载体属于此类,与原核细胞表达结果不一致,原因有待进一步研究。蛋白表达结果验证了原核细胞表达得到的结论,尤其是肯定了添加源自于SspDnaE内含肽原始C端外显肽氨基酸残基(CFNKS)有利于提高剪接效率3.在真核水平研究内含肽介导的被拆分的Barnase毒蛋白的N端和C端的功能重建结合原核表达和蛋白表达的结果,选择具有代表性的SN+SCG、SNZ+SCG、 NN+NC、NN+SCG四个组合构建了相应的植物表达载体PCABarSN/SCG、 PCABarSNZ/SCG、PCABarNN/NC、PCABarNN/SCG。载体中的N端融合基因和C端融合基因均在A9绒毡层启动子的驱动下表达。利用农杆菌介导法将其转入芥菜品种“渝丰榨菜”中,结果显示四个载体转化后获得的转基因植株均表现出明显的雄性不育,说明四个载体中的N端融合基因和C端融合基因在芥菜花药绒毡层表达后,内含肽均介导N端融合蛋白和C端融合蛋白的反式剪接,得到重组的Barnase蛋白,造成花药内细胞程序性死亡,花粉败育。其中的PCABarNN/NC、PCABarNN/SCG转基因植株出现花粉败育现象与原核细胞共表达和原核蛋白表达检测结果一致。而PCABarSN/SCG、 PCABarSNZ/SCG转基因植株也表现为雄性不育,与原核细胞共表达和原核蛋白表达检测结果不一致,出现该结果的原因估计是所用融合基因均参照甘蓝密码子使用偏好性设计的,在植物细胞中高表达后,对应内含肽组合即使只有较低的反式效率,但其生成的Barnase毒蛋白也足以导致绒毡层细胞凋亡而导致雄性不育的产生。