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研究背景新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxiac-ischemic encephalopathy,HIE)是指由于围生期窒息引起的缺氧缺血性脑损伤(hypoxiac-ischemic brain damage,HIBD),临床上表现为一系列中枢神经异常症状[1],如意识障碍、惊厥、肌张力改变等,并且在治疗后常遗留不同程度的神经系统后遗症。目前国内外对HIE的发病机制仍然不完全清楚,能量代谢障碍、氧自由基损伤、钙离子超载、兴奋性氨基酸的毒性作用、炎症反应、细胞凋亡等机制是目前研究较多的方面。治疗方面,在基本的“三支持”、“三对症”之上,除了传统的高压氧、亚低温、脑细胞代谢激活剂等疗法和药物治疗之外,神经营养因子、自由基清除剂、促红细胞生成素、干细胞移植疗法等新兴药物和疗法的研究正受到大家的青睐,但并未在临床广泛使用。中医药治疗HIE的报道日渐增多,也取得了一些疗效,比如丹参注射液、川芎嗪等有大量报道,证明其临床疗效。然而却日渐陷入“中药西用”的境地：多数的报道都是运用活血化瘀药治疗HIE或者单纯依据中药药理指导临床,缺少了中医辨证论治的理念；此外,将HIE病位限定于脑,也缺少了中医的整体观念。而中医“肾-脑”相关既有丰富理论支持,又有广泛临床实践,所以,本研究尝试用补肾代表方六味地黄汤以治疗西医学脑病HIE。研究目的跳出以往中医药研究HIE的思路和模式,基于中医学藏象学说中“肾与脑”的密切联系,运用六味地黄汤治疗新生大鼠HIBD,观察其治疗效果并探讨其作用机制,不仅为中医“肾-脑”相关、上病下取等理论提供了科学依据,也为中医学治疗现代脑病提供新的思路和治疗模式。文献研究文献研究列举了与HIE相似的中医儿科病名,如胎弱、梦生,等等,对其病因病机、治疗原则进行阐述。进而认为这些胎病的发生主要有两个原因：胎内因素和外感因素。而内因是本,外因是标,所以补肾固本、填精益髓、调理内因,是治疗胎病的最佳手段。在此基础上,从历史源流、物质基础、经络联属、临床研究、实验研究五个方面充分论证了“肾-脑”相关的合理性。最后对于六味地黄汤的现代药理研究以及其治疗现代脑病的进展也进行了论述。实验研究实验一：健康SPF级7日龄SD大鼠88只,雌雄不限,体重15±2克。实验动物随机分为2组,第一组56只,运用经典Rice-Vannucci模型方法进行常规造模处理；第二组32只,为实验对照组。第一组造模成功后再随机分为两组,即HIBD模型组(A组,n=32)、六味地黄汤组(C组,n=24),实验对照组设为假手术组(B组,n=32)。A组和B组再随机分成4个亚组,每组分别在造模完成2h、Id、3d、7d进行动物处死。C组则随机分为3个亚组,分别在造模完成给药后1d、3d、7d进行动物处死。中药组灌胃量为0.3ml/10g体积,每天1次,连续灌胃7d。模型组和假手术组则予同等剂量生理盐水灌胃。密切观察各组大鼠行为能力变化情况。各组分别在预先设定时间点断头取脑,石蜡切片行HE染色观察脑组织的病理变化。实验二、实验三在分组、造模灌胃方法、处死时间上均同实验一。实验二在断头取脑之前采用股动脉采血,分离血清。采用酶联免疫吸附法(Elisa)测定不同时间点样品中丙二醛,超氧化物歧化酶,神经元特异性烯醇化酶(MDA, SOD, NSE)的水平。实验三则采用逆转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)测定脑组织中HIF-1α的基因表达情况。实验结果1.行为能力改变：造模过程中以及造模后都会出现很多行为能力的改变,尤其是对侧肢体运动障碍,夹尾右旋,后期眼睑下垂、睁眼困难等改变具有特征性。假手术组无类似情况。药物组初期也有行为能力的改变,而后期逐渐消失2.HE染色：模型组病侧海马锥体细胞数量减少,排列紊乱,细胞核溶解、消失,细胞体变小,海马区域部分细胞可见水肿、空泡样变；假手术组也存在很轻微的病理改变,后期逐渐修复。药物组在初期的病理改变同模型组,后期逐渐恢复,与假手术组接近。3.NSE：模型组血清NSE水平2h即明显升高,且随时间逐渐升高,假手术组变化不明显,中药组则逐渐下降,与模型组相比,第3d、7d差异有统计学意义(p<0.05,p<0.01)4.MDA：模型组与假手术组MDA水平在2h无明显变化,1d时中药组与模型组相比有显著差异(p<0.01),而与假手术组接近,但在此后各时间点中药组与模型组差异不明显。5. SOD:SOD水平在2h无明显变化,而在1d、3d、7d时,模型组与中药组相比,具有显著差异(p<0.01),中药组SOD水平与假手术组接近。6. HIF-1 α:模型组HIF-1α的基因表达在2h即增强,1d时下降,随后又逐渐上升。与中药组相比,在3d、7d时具有显著差异(p<0.05)。中药组HIF-1α基因表达水平与假手术组接近。研究结论1. “肾-脑”相关,补肾治脑,具有丰富的理论支持和广泛的临床实践,这为六味地黄汤治疗治疗HIBD提供了理论支持。2.六味地黄汤能促进病变脑组织的修复,降低血清NSE浓度,提高脑组织SOD活性,并能下调HIF-1α的基因表达,对MDA含量也有一定的下调作用。3.六味地黄汤对新生大鼠HIBD损伤确有治疗作用。其作用机制与HIF-1α有关：通过提高SOD活性,降低MDA水平,然后通过二者对HIF-1α的调节机制从而下调HIF-1α的表达,保护缺氧缺血脑组织,促进受损神经元修复,降低血清NSE浓度。