1研究背景动脉粥样硬化斑块破裂或侵蚀引起的急性心血管事件是动脉粥样硬化患者发病和死亡的主要原因。因此,对稳定动脉粥样硬化斑块新疗法的需求不断增长。越来越多的证据表明,斑块内不成熟的新生血管由于其血管壁的不完整和渗漏使其成为导致斑块易损性增加和斑块破裂的重要因素。因此,斑块内新生血管可能成为易损斑块诊疗的新靶点。由于促血管生成因子和促成熟因子之间的不平衡,新形成的微血管壁仅由一层内皮细胞构成且缺乏壁细胞的包绕,这会导致渗漏的血管壁成为红细胞,脂质和炎性因子进入斑块内的入口。促血管生成的主要调节因子是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-A,研究表明干扰该因子可作为治疗肿瘤和周围动脉疾病的潜在方法。然而,在肿瘤和周围动脉疾病患者中使用抗VEGF-A药物的大规模临床试验结果令人失望。同样抑制斑块内新生血管是否能够改善斑块的易损性仍然缺乏可靠的证据,其中一个主要原因是缺乏合适的斑块内新血管动物模型,模型的缺乏使得众多研究结果之间存在巨大差异,从而使基于科学实验得到的结论变得更加复杂。Herrmann等研究者指出动脉粥样硬化和癌症病变的发展涉及血管生成的三个不同的病理解剖学阶段:起始期(initiation stage)、进展期(progression stage)、终末期(complication stage)。使用饲喂动脉粥样化高脂饮食3周的兔子模型进行起始期的研究,局部递送贝伐单抗(抗VEGF-A的单克隆抗体)抑制了斑块内的血管和动脉粥样硬化斑块的形成。虽然进展期、终末期与临床常见情况高度相关,但关于进展期与终末期的抗血管生成治疗的研究发现,在这两个阶段进行不恰当的抗血管生成治疗可能会诱发斑块内缺氧并导致内皮细胞凋亡,从而使新生血管内皮完整性丧失而引发斑块内出血。这一发现引起了人们对斑块内新生血管正常化治疗在易损斑块中重要性的关注。血管正常化是一种策略,促血管成熟生长因子可改善新生血管周细胞的覆盖率从而增加新生血管的成熟度。因此,阐明血管正常化的机制和信号传导途径,并验证其对斑块稳定性的影响至关重要。碱性成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)-2是刺激内皮细胞迁移和增殖并促进平滑肌细胞(Smooth muscle cells,SMCs)有丝分裂的有效生长因子。血小板衍生的生长因子-BB(Platelet-derived growth factor PDGF-BB)/PDGF受体-β(PDGFR-β)轴是表征血管周细胞募集的最佳信号系统。先前的研究表明,即使在低水平下,两种血管生成因子的共存可能比一个单独的高水平的生长因子产生更大的影响。因此,FGF-2与PDGF-BB联合可能对斑块新生血管正常化具有深远的意义。在这里,我们提出了一种新的策略,将FGF-2联合PDGF-BB过表达慢病毒局部递送到动脉粥样硬化斑块中,以诱导生长因子的稳定和持久表达并“正常化”斑块内新血管的结构和功能,从而改善斑块稳定性并探索其中主要的分子机制。2研究目的2.1观测斑块内FGF-2联合PDGF-BB过表达对斑块稳定的影响;2.2观测斑块内FGF-2联合PDGF-BB过表达对斑块内新生血管的影响;2.3探索FGF-2联合PDGF-BB刺激对周细胞迁移的影响;2.4探索FGF-2联合PDGF-BB刺激调控周细胞迁移的具体分子机制。3研究方法3.1 VEGF-A,FGF-2和PDGF-BB慢病毒载体的构建设计针对兔VEGF-A,FGF-2和PDGF-BB基因的shRNA质粒,应用蛋白免疫印迹法分析质粒的干扰效率,选择效率最高的质粒,构建成为含有绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)报告基因的慢病毒载体。3.2兔腹动脉粥样硬化模型的构建和慢病毒斑块内注射96只雄性新西兰大白兔(1.8-2.0kg)清洁级喂养环境,球囊拉伤其腹主动脉,给予高脂喂养12周后,在血管内超声(Intravascular ultrasound,IVUS)辅助下行斑块内注射术。随机选取6只进行预实验,斑块内注射GFP慢病毒,分别于注射后4周(n=3只)以及8周(n=3只)安乐死,检测斑块内慢病毒的转染效率。90只实验兔随机分为6组:Sham组(n=15只)、Vector组(n=15只,GFP=50μL)、VEGF-A 组(n=15 只,VEGF-A=50μL)、FGF-2 组(n=15 只,FGF-2=50μL)、PDGF-BB 组(n=15 只,PDGF-BB=50μL)、以及 FGF-2 联合PDGF-BB 过表达组(n=15 只,FGF-2/PDGF-BB=25μL)。3.3各组实验兔血液生化指标的检测实验兔接受斑块内注射后8周,安乐死之前,于兔耳中动脉抽取动脉血行血脂检测。离心分离血清后利用ELISA技术检测各组实验兔血清中VEGF-A、FGF-2、PDGF-BB表达水平。3.4血管内超声(IVUS)检查实验兔接受斑块内注射后8周,于安乐死之前,利用IVUS技术获取各组实验兔斑块管腔面积、外弹力膜面积、斑块面积和斑块负荷来评价斑块形态。3.5组织病理学检测各组实验兔取材后,制备石蜡切片进行H&E染色以观测斑块组织形态,天狼猩红染色检测斑块内各型胶原含量。制备冰冻切片,行油红-O染色检测斑块内脂质含量。3.6免疫组织化学染色各组实验兔取材后,制备石蜡切片行免疫组织化学染色,检测斑块内巨噬细胞(RAM-11)、平滑肌细胞(α-SMA)、红细胞、新生血管(CD31)、以及缺氧诱导因子(HIF-1α)的表达以及分布情况。3.7免疫荧光化学染色各组实验兔取材后,制备石蜡切片行免疫荧光化学双标染色,检测斑块内新生血管结构(CD31/NG2)、VEGF-A、FGF-2、PDGF-BB 及其相关受体 FGFR-1、FGFR-2及PDGFR-β在斑块内的细胞定位。3.8逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)提取各组实验兔腹主动脉斑块总RNA,分别检测斑块组织内VEGF-A、FGF-2、及其PDGF-BB的基因表达水平。3.9细胞培养实验分别利用b.END3细胞以及10T1/2细胞作为内皮细胞以及Pericyte细胞的实验对象,以 FGF-2(50ng/mL),PDGF-BB(10ng/mL)以及 FGF-2 联合PDGF-BB为刺激,分别刺激周细胞5min、15min、以及60min。3.10细胞划痕实验利用划痕实验来观察FGF-2(50ng/mL),PDGF-BB(10ng/mL)以及FGF-2联合PDGF-BB诱导对周细胞迁移的影响。3.11 细胞 Transwell 实验利用 Transwell 实验来观察 FGF-2(50ng/mL),PDGF-BB(10ng/mL)以及FGF-2联合PDGF-BB诱导对周细胞迁移的影响。3.12周细胞-内皮细胞粘附实验利用 PKH26 标记内皮细胞,carboxyfluorescein succinimidyl ester 标记周细胞,观察 FGF-2(50ng/mL),PDGF-BB(10ng/mL)以及 FGF-2 联合 PDGF-BB刺激对周细胞向内皮细胞迁移率的影响。3.13细胞干预采用小干扰siRNA技术转染siRNA-epn2抑制周细胞Epsin2的基因表达,小干扰siRNA-N.C作为阴性对照组。3.14 Western-blot提取各组实验兔腹主动脉斑块组织蛋白,分别检测斑块组织内VEGF-A、FGF-2、PDGF-BB及其相关受体FGFR-1、FGFR-2及PDGFR-β的蛋白表达水平。收集各组周细胞,提取总蛋白,分别检测VEGFR-2、p-VEGFR-2、Epsin1/2、PDGFR-β、p-PDGFR-β和GAPDH的蛋白表达水平。3.15统计学分析数据均采用SPSS 17.0软件进行统计分析,并以均数±标准误(Mean±SEM)表示,P<0.05认为差异有统计学意义。4实验结果4.1实验动物的一般情况各组实验动物在斑块内注射术后均基本恢复良好,其中FGF-2组中有2只实验兔术后5天死于伤口感染。Vector组中2只实验兔术后12天死于腹泻。实验结束前称取实验兔体重,各组实验兔的体重没有统计学差异。4.2各组实验动物的基本指标实验结束前,检测各组实验兔血脂,各组实验兔血脂水平没有差异。通过RT-PCR检测得到,各组实验兔斑块内的慢病毒载体均有效表达。各组实验兔血清中VEGF-A、FGF-2以及PDGF-BB的表达水平也没有差异。根据免疫荧光双标定位可见,VEGF-A、FGF-2以及PDGF-BB在斑块中广泛表达,根据斑块细胞分布的空间定位可见,与VEGF-A组与FGF-2组相比,PDGF-BB组以及FGF-2联合PDGF-BB过表达组中VEGF-A以及FGF-2主要表达在巨噬细胞,而PDGF-BB主要表达在平滑肌细胞。实验兔在安乐死之前都进行了 IVUS检查,管腔面积和外弹力膜面积在各组之间没有差异,但相对于Sham组、Vector组、VEGF-A组以及FGF-2组中斑块面积和斑块负荷明显升高。FGF-2联合PDGF-BB过表达组中斑块负荷显著降低。4.3 FGF-2联合PDGF-BB过表达能够减小斑块坏死核的面积通过内皮细胞与平滑肌细胞免疫荧光双标染色以及斑块内细胞分布的空间分布定位显示斑块内坏死核面积,结果发现,与VEGF-A组以及FGF-2组相比FGF-2联合PDGF-BB过表达显著减小了斑块坏死核心的面积。4.4 FGF-2联合PDGF-BB过表达能够增加斑块的稳定性免疫组织化学染色以及天狼星红染色显示,FGF-2联合PDGF-BB组中巨噬细胞的含量相对于其他组明显减少,平滑肌细胞以及胶原的含量在PDGF-BB组以及FGF-2联合PDGF-BB组中明显升高。易损性分析显示,FGF-2联合PDGF-BB过表达显著降低了斑块的易损指数增加了斑块的稳定性。4.5 FGF-2联合PDGF-BB过表达减轻了斑块的缺氧程度并促进了适宜数量的斑块内血管新生根据内皮细胞标记物CD31免疫组织化学染色显示,与FGF-2组或者PDGF-BB组相比,FGF-2联合PDGF-BB过表达组斑块内新生血管的数量显著减少。哌莫硝唑染色显示,FGF-2联合PDGF-BB过表达组斑块内缺氧水平明显低于FGF-2组或者PDGF-BB组。同时Western Blot检测显示FGF-2联合PDGF-BB组中HIF1-α的蛋白水平明显低于FGF-2组或者PDGF-BB组。4.6 FGF-2联合PDGF-BB过表达减少了斑块内新生血管的渗透性伊文思蓝染色,H&E染色以及Glycophorin A免疫荧光化学染色显示,FGF-2联合PDGF-BB过表达组斑块内几乎没有游离红细胞,在VEGF-A组以及FGF-2组斑块内可见多量游离在新生血管外且聚集的红细胞。4.7 FGF-2联合PDGF-BB过表达增加了斑块内新生血管壁周细胞的包覆率为了评估FGF-2联合PDGF-BB过表达对斑块内新生血管成熟度的影响,使用CD31(内皮细胞标记物)和NG2(周细胞标记物)免疫荧光双标染色来计算斑块组织切片中新生血管周细胞的包覆率。结果显示,与对照组相比,FGF-2联合PDGF-BB过表达的斑块中CD31+与NG2+双阳性的新生血管数量显著增加,这表明FGF-2联合PDGF-BB过表达诱导了周细胞向内皮细胞的募集。通过透射电镜检测新生血管内皮细胞间连接和周细胞覆盖率。在VEGF-A和FGF-2组中观察到明显的血管内皮细胞间裂隙。相比之下,FGF-2与PDGF-BB联合过表达组中的新血管内皮细胞连接完整且周细胞覆盖紧密。4.8 FGF-2联合PDGF-BB过表达诱导了斑块中FGFR-2以及PDGFR-β的表达免疫荧光双标染色以及Western Blot检测显示,FGF-2联合PDGF-BB过表达组斑块中FGFR-2以及PDGFR-β蛋白表达的水平显著增加。FGF-2联合PDGF-BB过表达能够有效的激活新生血管成熟的相关信号通路。4.9 FGF-2联合PDGF-BB刺激诱导周细胞的迁移通过细胞划痕实验以及Transwell小室迁移实验证实,与对照组相比,FGF-2联合PDGF-BB刺激能够显著增加周细胞的迁移。4.10 FGF-2联合PDGF-BB刺激诱导周细胞向内皮细胞的迁移通过周细胞-内皮细胞粘附实验检测游离周细胞向内皮细胞的迁移。荧光图像分析显示,与对照组相比,FGF-2联合PDGF-BB刺激诱导周细胞向成管内皮细胞迁移增加。4.11 FGF-2联合PDGF-BB时间依赖性抑制周细胞中VEGFR-2的磷酸化分别采用FGF-2、PDGF-BB、以及FGF-2联合PDGF-BB刺激周细胞5min、15min、60min。Westem blot 结果显示,与 NT 组相比,FGF-2 联合 PDGF-BB在刺激周细胞5min、15min、和60min后显著抑制了 VEGFR-2的磷酸化。4.12 FGF-2联合PDGF-BB时间依赖性诱导周细胞中Epsin2的表达分别采用FGF-2、PDGF-BB、以及FGF-2联合PDGF-BB刺激周细胞5min、15min、60min。Western blot 结果显示,与 NT 组相比,FGF-2 联合 PDGF-BB在5min、15min、和60min显著增加了 Epsin-2的表达。利用Epsin-2siRNA可明显抑制周细胞中Epsin2的蛋白表达。Western blot结果显示,与NT组相比,抑制周细胞中Epsin2的表达能够显著增加VEGFR-2的磷酸化,并且降低PDGFR-β的磷酸化。通过周细胞-内皮细胞粘附实验显示,与NT组相比,抑制周细胞中Epsin2的表达能够显著降低周细胞向内皮细胞的迁移粘附。5结论5.1 FGF-2联合PDGF-BB过表达能够减少斑块内新生血管数量、斑块内出血以及坏死核面积,从而稳定易损斑块;5.2 FGF-2联合PDGF-BB过表达能够增加斑块内新生血管周细胞的包覆率;5.3 FGF-2联合PDGF-BB刺激诱导周细胞Epsin-2的表达,抑制VEGFR-2的磷酸化,从而增加增加周细胞的迁移。1.研究背景:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)斑块破裂后血栓形成,是导致急性心脑血管事件并导致高发病率和高死亡率的主要原因。这些易破裂的斑块称为易损斑块,其特征在于以巨噬细胞浸润为特征的活动性炎症,以及典型的大脂质核和薄纤维帽。尽管中性粒细胞是循环白细胞的最大种群,但在AS斑块中中性粒细胞却很少得到关注。近年来,越来越多的研究证实,中性粒细胞在AS的发生发展过程中,发挥了重要的作用。中性粒细胞是固有免疫系统的重要组成部分,能够防御入侵的病原体。被病原体活化的中性粒细胞将“靶向”动脉粥样硬化斑块的损伤内皮随后迁移到斑块中。研究也发现,在易损斑块中内流的中性粒细胞也可以与巨噬细胞共定位。中性粒细胞的寿命虽然只有短暂的1-2天,但其后凋亡的中性粒细胞被巨噬细胞吞噬,这种快速吞噬作用能够使巨噬细胞极化为抗动脉粥样硬化表型,从而恢复斑块稳态。中性粒细胞的固有的免疫反应特性可用于增加局部药物浓度。吴玫颖等研究者报道了利用中性粒细胞肿瘤归巢的特性,将阿霉素内化的中性粒细胞用于脑胶质瘤术后残余病灶的诊断和治疗。动脉粥样硬化斑块是大到中型动脉的病变,具有高剪切力的血流状态。这阻碍了药物载体与内皮细胞的结合以及所递送的药物在斑块内的积累。现阶段较为常用的分子生物影像方法在AS的诊断和治疗过程中遇到了瓶颈,主要有两方面原因:第一,目前较为常用的靶向微泡制作方法是通过生物素-链霉素在微泡表面连接靶向的基序或配体(例如连接素,整联蛋白和细胞粘附分子等),虽然这些基序或配体能够通过结合能力提供连接支撑,但这可能还不够。另一方面,易损斑块中的炎症涉及许多细胞因子,而通过单个分子标记物无法对其进行足够的靶向。相比之下,中性粒细胞通过变形,生出捕获键(catchbonds),长系绳(long tethers)和吊索(slings),能够在高剪切力下滚动。它们能够穿越血流并迁移到动脉粥样硬化斑块中。因此,中性粒细胞被认为是一种有潜力的基于细胞的药物递送系统(cell-based drug delivery system),可针对易损斑块进行靶向干预。微泡(Microbubbles,MB)已被广泛应用为多功能载体,因为它们不仅能够递送药物,而且能够在超声下增强显影和靶向性。且Anne Rix等报道,药物可以通过微泡传递到动脉粥样硬化斑块中。增强机制涉及微血流动力学,声孔作用,声辐射力等,这可有益于靶部位微泡的富集。综上所述,我们构建了一个中性粒细胞与微泡的复合体即中性粒细胞-微泡(Neutrophil-Microbubble)复合物,以模仿中性粒细胞对易损斑块炎症的反应。中性粒细胞可被用作靶向抗体,以迅速、牢固地将这个仿生多功能复合体护送到易损斑块上。同时,微泡充当载体、声学示踪剂和信号放大器。2.研究目的2.1构建中性粒细胞-微泡复合体,并对其进行表征和检测;2.2检测中性粒细胞-微泡复合体在静态以及Flow-chamber平行板流动腔状态下的体外靶向能力;2.3检测中性粒细胞-微泡复合体对小鼠主动脉斑块的超声分子成像;3.材料方法:3.1分离外周血中性粒细胞根据文献描述的中性粒细胞Percoll梯度分离法分离中性粒细胞。从高脂喂养4周的ApoE-/-小鼠全血中分离中性粒细胞。将血液收集在肝素处理的离心管中,离心(400×g,10分钟,4℃)纯化,然后在含有EDTA的PBS中稀释。后将细胞沉淀小心地添加到三层Percoll(78%,69%和52%)的顶部,后以1500×g的速率离心,室温下30分钟。从69/78%界面和78%层的上部吸出中性粒细胞。在4℃下用裂解缓冲液裂解残留的红细胞后,可获得高纯度的嗜中性粒细胞。3.2组装仿生多功能中性粒细胞-微泡复合体制备全氟丙烷(C3F8)气核的生物素化微泡。微泡壳层由DSPC、DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-biotin合成。微泡(109个/ml)保存在带有C3F8气体的密封西林瓶中,以防止漏气。为了制备靶向微泡,将100μl生物素化微泡用PBS洗涤两次,每次离心(400×g,3分钟,4℃),以除去多余的生物素,然后复溶于PBS中。接下来,加入链菌素(1mg/ml),并将混合物在24℃下旋转孵育25分钟。再次通过离心(400g,3min,4℃)洗涤微泡,以除去未结合的链菌素。接下来,添加生物素化的大鼠抗小鼠CD11b单克隆抗体,并将混合物在24℃下旋转孵育25分钟。再次洗涤这些靶向的微泡并将其溶解在DMEM培养基中。使用Multisizer 3 Coulter计数器来确定微泡的最终浓度。最后将中性粒细胞与CDllb-靶向微泡以100:1的比例在室温下连续旋转孵育25分钟。使用显微镜观测复合物的形态和大小,每个视野至少分析10个中性粒细胞-微泡复合物。3.3细胞活力测定将中性粒细胞(每孔5×103)或Neutrophil-Microbubble复合物(每孔5×103)接种到96孔板中,然后加入CCK-8试剂,在5%CO2中于37℃放置2小时。在450mn 下测量光密度值(OD)。根据[(ODNeutrophil+ODblank)/(ODcontrol+ODblank)]×100%公式计算细胞活力。3.4吲哚菁绿(ICG)负载中性粒细胞首先,将ICG溶于100 μLDMSO中。向混合物中加入400μLDMEM+10%胎牛血清摇匀,ICG溶液的终浓度为2mg/ml。加入转染试剂鱼精蛋白。将300μL ICG和300μL无血清DMEM与5 μL硫酸鱼精蛋白混合,调整ICG终浓度为10 mg/ml,5分钟摇匀。中性粒细胞用吸管轻轻吹打3次,加入ICG/鱼精蛋白混合溶液,37℃孵育1小时,后以400r/5分钟离心去除未结合的ICG/鱼精蛋白。最后将细胞重悬在无菌PBS中。使用Synergy 4酶标仪根据ICG的荧光强度检测中性粒细胞与配体的结合效率。3.5中性粒细胞-微泡复合体在静止状态下对炎性内皮细胞的粘附使用TNF-α(10ng/ml)和ox-LDL(60mg/L)刺激的bEnd.3细胞来检测中性粒细胞-微泡的静态粘附能力。将MBIgG,MBCD11b或中性粒细胞-微泡复合体复合物(5×106/ml)加入预先种有bEnd.3的24孔板中。将细胞板用封板膜密封,倒置放置5分钟。后用PBS洗除游离的中性白细胞和MB,然后在光学显微镜下选取五个随机的明亮视野计数附着的中性粒细胞-微泡复合体的数目。3.6中性粒细胞-微泡复合体在平行板流动腔状态下对炎性内皮细胞的粘附使用Flow-chamber平行板流动腔连接的圆形环路来进行中性粒细胞-微泡复合体动态附着能力测定。平行板流动腔设备存放在37℃的5%CO2培养箱中。将bEnd.3细胞种在μ-Slide腔中,将含有中性粒细胞-微泡复合体,MBCD11b和MBIgG的培养基在4 dynes/cm2的剪切应力下围绕μ-Slide腔流动1、2、4和8分钟。然后,将这三种培养基在4、8、12、16dynes/cm2的剪切力下通过μ-Slide腔流动4分钟。每种MB和中性粒细胞-微泡混合物均进行5次重复测量。3.7蛋白质印迹分析(western-blot)提取bEnd.3细胞的总蛋白,并通过BCA检测试剂盒检测细胞蛋白浓度。将PVDF 膜与细胞间粘附分子-1(Intracellular adherent molecular,ICAM-1),和β-actin的特异性一抗在4℃孵育12小时,然后与二抗孵育2小时。通过增强的化学发光试剂盒可视化蛋白质条带。用Image J软件分析结果。3.8动脉粥样硬化动物模型所有ApoE-/-小鼠(10周龄,雄性)和C57小鼠(10周龄,雄性)均从南方医科大学的实验动物中心获得。遵循实验室动物护理的原则,并努力将实验动物的痛苦降到最低。该研究方案已获得中国科学院深圳先进技术研究院动物研究医学伦理委员会的批准(伦理号KY2016-090)。将15只ApoE-/-小鼠平均分为3组,分别给予致动脉粥样硬化饮食(0.25%胆固醇,15%可可脂)8周,16周或24周。年龄相同的C57小鼠(n=15)作为对照组,也遵循相同的分组和喂养方案3.9中性粒细胞-微泡复合体在体内仿生行为的声学示踪在氧气中加入异氟烷(2 L/min)麻醉小鼠,并通过尾静脉注射50μL超声对比剂(1×107)。使用MS250非线性传感器从小鼠右侧胸骨旁窗扫描主动脉弓的长轴平面。在各型MB注射4分钟后,使用高频超声破碎脉冲序列来破碎MB。使用VEVOCQ软件分析破碎前后感兴趣区(ROI)的声学强度(a.u)差值。3.10.ICG-中性粒细胞-微泡复合体体内运输通过尾静脉注射指定浓度的ICG-中性粒细胞和载有ICG-中性粒细胞-微泡复合体,使其循环指定的时间,进行剂量依赖或者时间依赖曲线实验。安乐死后,解剖每组小鼠的主动脉以进行荧光测定。将解剖的主动脉包埋在超声耦合剂中,并通过自制的荧光显微镜(空间分辨率为100 um)在发射波长780 nm处成像。3.11组织学和免疫组化实验动物安乐死后,迅速分离切除主动脉。每个标本都用4%多聚甲醛固定并包埋在石蜡中以进行H&E染色和免疫组织化学染色。使用H&E染色对厚度为5μm的斑块连续横截面进行染色,并通过光学显微镜进行观察。用抗平滑肌细胞抗体(1:200稀释度)和抗CD68抗体(1:200稀释度)对标本进行免疫组织化学染色,以进行斑块组织成份鉴定。由两个独立的观察者(M.Y和S.Y)进行计数,并使用两个值的平均值进行分析。3.12统计分析所有数据分析均由SPSS 18.0版本进行。P<0.05被认为具有统计学意义。连续变量以平均值±标准误(mean±standard error)表示。使用单因素方差分析来进行两两比较。进行方差齐性检验,方差齐时使用the least squares difference test,当方差不齐使用Dunnett’s T3检验来检验两组之间差异的显着性。声学参数和组织学数据之间的相关性进行了 Pearson相关性分析。4.结果4.1中性粒细胞-微泡复合体的表征以及声学特性检测每个中性粒细胞偶联3.4±1.2个微泡,平均直径为8.4±1.2μm。尽管中性粒细胞寿命较短,但制备过程和超声(500 Hz,5%,0.35 Mpa,255 W/cm2)作用并未影响它们的活性。我们还通过生物素-亲和素方法制备了 MBIgG和MBCD11b靶向微泡,作为体内研究的对照。4.2中性粒细胞-微泡复合体对b.End.3细胞体外炎症模型的靶向黏附为了验证Neutrophil-balloon的体外细胞靶向功能,静态粘附实验证实,复合体对炎性bEnd.3细胞的亲和力比MBIgG或MBCD11b的亲和力显著增加(P<0.05)。为了进一步测试复合体抗高剪切力的能力,Flow-chamber平行板流动腔创建了梯度剪切力的环境。在4-16 dynes/cm2的剪切力作用下,循环4分钟后,复合物的对炎性bEnd.3细胞的附着力明显高于MBCD11b(P<0.05)。此外,从1分钟到8分钟的时间内,将剪切力恒定保持在4 dynes/cm2,结果可见复合体在炎性bEnd.3细胞的附着数量显著高于MBCD11b(P<0.05)。此外,不管是静态粘附实验条件下或高剪切力状态下,使用E-选择素和ICAM-1的特异性抑制剂2,4-二取代噻吩并[2,3-c]吡啶(A-205804)都能够抑制复合物或MBCD11b与炎性b.END3的结合。4.3中性粒细胞-微泡复合体的体内超声成像检测在高脂喂养的Apo E-/-小鼠模型上进行Neutrophil-Microbubble复合体斑块亲和力仿生行为的体内验证,结果经Vevo CQ软件系统计算分析,得到三种微泡的超声分子成像数据。经统计分析可得,高脂喂养10周后Neutrophil-Microbubble的成像强度显著高于MBIgG或MBCD11b(P<0.05)。分别于ApoE-/-小鼠高脂饮食8周、16周、以及24周后,在每一个时间点进行复合体与MBCD11b超声分子成像检测。结果经统计分析可见,随着高脂喂养的时间的延长,复合体的成像效果显著高于MBCD11b(P<0.05)。在每一个时间点,选取小鼠主动脉成像部位血管组织进行Oil O-Red和Picric-Sirius red的组织学染色以及抗α-actin和抗CD68免疫组织学染色,结果经统计分析证实斑块中的巨噬细胞和脂质含量随高脂喂养时间增加而增加,而胶原蛋白和平滑肌细胞的含量则随之减少,最终导致斑块易损性的增加表现为易损指数的增加(P<0.05)。利用Pearson相关性分析可得,斑块中巨噬细胞的含量、易损指数均与复合体成像的声学强度呈正相关(两者均P<0.01)。综上所述,在主动脉高剪切力的血流环境下,Neutrophil-Microbubble复合体对斑块的靶向性随着斑块炎症程度的增加而增加。4.4 ICG-中性粒细胞-微泡复合体荧光成像经Apo E-/-小鼠尾静脉注射ICG-复合体后的0.5h,1h,3h,6h,12h和24h利用荧光成像系统检测了斑块内的荧光强度。结果经统计分析可见,荧光强度在注射后1小时达到最高峰,后在24小时左右逐渐衰减。此外,当复合体浓度从5×107个/ml到1×109个/ml逐渐增加时,斑块的荧光强度也逐渐随之增强。通过大体油红O染色,统计分析8周、16周以及24周每个时间点斑块的面积,通过Pearson相关性分析可得,斑块的荧光强度与斑块的面积呈正相关(P<0.01)。5.结论5.1成功制备了中性粒细胞-微泡复合体;5.2体外验证了中性粒细胞-微泡复合体在静态以及高剪切力情况下的体外黏附能力;5.3体内验证了中性粒细胞-微泡复合体对小鼠主动脉斑块的靶向力。