论文部分内容阅读
泽漆(Euphorbia helioscopia L.)为大戟科(Euphorbiaceae)大戟属(Euphorbia)草本植物,全株含乳汁。作为一种古老的民间草药,其有效成分为萜类化合物。萜类作为植物界中最广泛的一种次级代谢产物,合成萜类化合物碳骨架的途径主要有两条,即发生在细胞质中的甲羟戊酸(MVA)途径及发生在质体中的2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径。泽漆中的乳汁管是其萜类化合物合成和储存的主要场所,通过对泽漆乳汁蛋白质组学的研究我们鉴定出多种蛋白质,其中包括与萜类合成相关的酶,乙酰辅酶A乙酰转移酶(AACT)和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MDC),这两种酶是MVA途径中的关键酶。我们课题组已经成功的克隆出AACT和MDC两种酶的基因,分别命名为EhAACT(登陆号:KP995935)和EhMDC(登陆号:KP995936),并且将这两种基因进行原核表达,获得了表达蛋白。为了深入了解乳汁管中萜类物质的合成部位、转运以及积累,本论文通过实时荧光定量PCR技术对EhAACT和EhMDC两种基因在泽漆不同器官的表达进行定量分析。并用所获得的表达蛋白制备抗体,通过免疫印迹技术(Western Blot)以及胶体金免疫电镜技术,对泽漆乳汁管中的AACT和MDC两种酶在蛋白、细胞和细胞器水平上进行免疫定位分析,从而为泽漆乳汁管中萜类化合物的合成与调控提供理论依据。主要研究结果有以下几个方面:1.通过RT-PCR技术对EhAACT和EhMDC两个基因在泽漆不同组织中的转录水平进行分析,实验结果表明EhAACT基因在根、茎、叶中的转录水平几乎一致,不存在显著性差异;EhMDC基因在根、茎、叶各个器官中均有表达,且表达量具有显著差异(P<0.05),在根中的表达量比叶与茎中的较高,然而在叶与茎中转录水平几乎相同。2.分别将纯化的AACT蛋白和MDC蛋白作为抗原进行抗体制备,并采用酶联反应检测抗体效价,抗AACT和抗MDC多克隆抗体的效价均约为1:400000。3.提取泽漆乳汁中的总蛋白,通过Western Blot技术分析AACT蛋白和MDC蛋白在泽漆乳汁管中的表达。结果显示,抗AACT抗体识别出一条分子质量大约为43 kDa的条带,抗MDC抗体识别出分子质量大约为46 kDa的单一条带。说明泽漆的乳汁管中确实存在这两种酶,并且可能参与乳汁管中萜类物质的合成。4.通过胶体金免疫电镜技术,对AACT和MDC在泽漆乳汁管中进行亚细胞定位分析,发现AACT和MDC都主要分布在细胞质,内质网及起源于内质网的小泡中。这一结果为萜类物质的生物合成与调控提供理论依据。