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猪肉是我国居民日常生活中动物性蛋白的主要来源。对猪的肉质性状研究一直是动物遗传育种学家研究的重点。应用现代分子生物学、分子遗传学及数量遗传学等技术进行猪骨骼肌生长发育的分子机理研究,能够增进人们对动物肌肉生长发育规律的深入认识,进而促进动物产肉性状的遗传改良。
MSX1(muscle segment homeobox homolog1,肌节同源异型框基因)是核转录抑制因子,与TATA box结合蛋白及其它因子共同形成核转录复合物,是器官发育过程中的主调控基因之一。在模式生物如小鼠中的研究表明,MSX1与成肌调控因子MyoD、Pax3等发生作用,调控骨骼肌细胞的分化过程。本研究将MSX1基因作为影响骨骼肌生长发育的候选基因进行研究,结合生物信息学方法及分子生物学技术分离其cDNA,而后开展染色体定位、时空表达谱分析、亚细胞定位和有效siRNA筛选等研究,为深入探讨该基因在猪骨骼肌细胞增殖、分化中的作用提供基础资料。本研究取得如下结果:
1.依据人MSX1基因cDNA信息,在NCBI数据库中搜索猪的EST信息,将搜索到的猪EST拼接成EST重叠群。以该序列信息为基础设计引物,克隆获得猪MSX1基因完整CDS序列及包含AATAAA序列在内的3’非翻译区(3’-UTR)。
2.利用辐射杂种板(RH)和体细胞杂种板(SCHP)分别对猪MSX1基因进行染色体区域定位和精细定位。结果表明,MSX1位于SSC8(1/2 p21)-p23,与微卫星S0353紧密连锁(LOD=10.22),还与微卫星SW2410和S0098紧密连锁。
3.利用半定量RT-PCR技术检测MSX1基因在猪心脏、肝脏和骨骼肌等组织中mRNA的表达量,发现该基因在所检测组织中均有表达,其中在脾脏中表达量最高,其次为心脏和骨骼肌组织。
4.利用半定量RT-PCR技术对猪MSX1基因在通城猪胚胎33天、65天、90天和出生后2天、28天的骨骼肌及长白猪33天、65天、90天胚胎骨骼肌中mRNA的表达量,结果发现该基因在胚胎期表达量逐渐降低,在出生后2天骨骼肌中表达量升高,然后又呈降低趋势。
5.构建猪MSX1基因GFP融合蛋白表达载体,转染猪肾细胞系才细胞,应用激光共聚焦技术对融合蛋白的分布进行检测,结果显示猪MSX1-GFP融合蛋白主要表达于细胞核中。
6.分别利用shRNA表达载体和化学合成Stealth siRNA方法制备siRNA序列,借助IB细胞,对靶向猪MSX1基因siRNA序列进行筛选,得到2条靶向猪MSX1基因的有效序列。