【摘 要】
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目的检测肿瘤坏死因子受体相关因子相互作用蛋白(Tumor necrosis factor receptor-associated factor interaction protein,TRAIP)在三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)组织和细胞中的表达水平,分析TRAIP的表达与TNBC患者临床病理资料的关系;检测TRAIP敲降和过表达对TNBC细胞
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目的检测肿瘤坏死因子受体相关因子相互作用蛋白(Tumor necrosis factor receptor-associated factor interaction protein,TRAIP)在三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)组织和细胞中的表达水平,分析TRAIP的表达与TNBC患者临床病理资料的关系;检测TRAIP敲降和过表达对TNBC细胞的增殖、侵袭和转移的影响并探讨其潜在分子机制;检测沉默TRAIP对裸鼠皮下肿瘤生长及肺转移瘤的影响。方法采用TCGA数据库确定目标基因;采用UALCAN和kaplan-meier plotter数据库分析TRAIP在乳腺癌中的表达及预后情况;应用Quantitative real-time PCR(q RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测8对新鲜TNBC及癌旁相对正常组织中TRAIP的表达水平;采用免疫组织化学方法检测75对TNBC组织及癌旁相对正常组织TRAIP的表达,应用Wilcoxon分析TRAIP与临床病理资料之间的关系;构建TRAIP敲降、过表达慢病毒载体并进行转染;采用CCK-8法、平板克隆形成实验、流式细胞术、创伤愈合实验和transwell侵袭转移实验检测TRAIP对TNBC细胞增殖及侵袭转移能力的影响;采用WB方法检测TRAIP对Rb-E2F信号通路和上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transformation,EMT)途径相关蛋白表达水平的影响;构建裸鼠异种移植瘤和肺转移瘤模型。结果UALCAN数据库显示,与正常乳腺组织相比,TRAIP在乳腺癌中呈高表达水平(P<0.001);与腔管型或HER2阳性型乳腺癌相比,TNBC中TRAIP表达显著增加(P<0.001);此外,TRAIP高表达与总生存期显著相关(P<0.05)。q RT-PCR和WB结果显示,TRAIP的m RNA和蛋白水平在肿瘤组织中的表达明显高于相应的癌旁组织(P<0.01),提示TRAIP在TNBC组织中过表达。免疫组织化学染色结果显示,与癌旁相对正常组织相比,TRAIP在TNBC组织中高表达;与配对的原发灶相比,淋巴结转移灶中TRAIP表达显著增高,与无淋巴结转移的癌组织相比,TRAIP在有淋巴结转移的癌组织中表达更高(P<0.01),并与患者的复发密切相关(P<0.05)。CCK-8和集落形成实验结果显示,与对照组相比,TRAIP敲降组的细胞增殖明显受到抑制,而TRAIP过表达后可显著促进TNBC细胞的增殖(P<0.01)。流式细胞术结果显示,TRAIP敲降组的G1期细胞明显富集,S期细胞数量减少,TRAIP过表达组的G1期细胞却明显减少,S期细胞数量显著富集(P<0.01)。为进一步探讨TRAIP调控细胞增殖的分子机制,采用WB法检测Rb-E2F通路上的主要蛋白表达水平的变化,结果显示,与对照组相比,TRAIP敲降组Rb、phospho-Rb、E2F1、Cyclin D1和Cyclin E表达1降低,而P21升高,TRAIP过表达组则相反(P<0.05或0.01)。创伤愈合实验和transwell实验结果显示,TRAIP敲降组的细胞侵袭转移能力较对照组显著减弱,TRAIP过表达后细胞的侵袭转移能力显著增加(P<0.01)。为进一步探讨TRAIP在EMT中的作用,采用WB方法检测EMT途径主要分子的蛋白表达水平的变化,其结果显示,与对照组比较,TRAIP敲降组的E-cadherin表达增加,MMP-2、MMP-9、Twist、Slug、Vimentin表达减少;然而,TRAIP过表达后结果则相反(P<0.05或0.01)。动物实验结果显示,与对照组相比,TRAIP敲降组的裸鼠肿瘤重量(533±32mg vs 178±34mg)和肿瘤大小(1430.2±26.9mm3 vs584.8±12.28mm3)显著降低(P<0.05或0.01);此外,TRAIP敲降组的5只小鼠中有2只发生肺转移,而对照组5只小鼠均发生肺转移。结论TRAIP在TNBC组织和细胞中呈高表达水平。此外,TRAIP可能通过Rb-E2F信号通路和EMT途径调控TNBC细胞的增殖、侵袭和转移,提示TRAIP可能在TNBC的发生发展发挥关键调控作用。
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