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第一章大鼠KPNA1基因的克隆和表达研究
在帕金森病病人中,腹侧中脑多巴胺能神经元的死亡导致了纹状体的去神经支配,进而造成一系列病理变化,但是这些病理变化的分子机制并不清楚。本文在帕金森病大鼠模型的去神经支配纹状体中发现并克隆了一个高度上调的基因,karyopherinα1(KPNA1)。KPNA1是核转运蛋白家族的一员,负责将细胞质中的蛋白质选择性地转运到细胞核。本文克隆的大鼠KPNA1的转录本全长4975碱基,包括一个短的5,端非翻译区70碱基,一个1617碱基的翻译区,和一个特别长的3266碱基的3,端非翻译区。大鼠KPNA1基因与小鼠和人的同源基因无论在核酸还是蛋白质水平都具有很高的同源性。在基因组水平对该基因的生物信息学分析表明,其全长达4.4万碱基,包括13个外显子和12个内含子。外显子长度最短的为第6外显子(89碱基),最长的为第13外显子(3454碱基)。内含子的长度从300到9000碱基不等。反转录-聚合酶链式反应的结果表明,KPNA1在成年大鼠的多种组织中表达。Northern杂交和半定量反转录-聚合酶链式反应的结果证实,KPNA1的表达水平在帕金森病大鼠模型去多巴胺能神经支配的纹状体中上调,在损伤两周以后达到较高水平,然后开始下降。研究提示,KPNA1可能参与了6-羟基多巴胺损毁导致的帕金森病模型中纹状体对去神经支配的病理反应。
第二章胶质细胞源性神经营养因子α受体样基因的克隆和功能研究
胶质细胞源性神经生长因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)家族有四个成员,分别是GDNF,Neurturin,Persephin和Enovin/Artemin,它们对神经系统的生长发育以及各个独特的神经元群体的维持都起到了重要的作用。这四个成员都是分泌性蛋白,分泌到细胞外以后,通过特殊的跨膜信号传导机制将信号传到胞内使神经元发生反应。传导信号的结构包括两种蛋白,α型受体和c-Ret。已经发现有四种α型受体,分别命名为GFRα-1到GFRα-4。这四种α型受体没有跨膜结构,通过GPI锚锚定在细胞膜上。GDNF家族的四个成员分别与一种GFRα结合以后,再通过共同的跨膜受体c-Ret将信号传导到胞内。最近本文克隆到了一个新的与GFRα序列相似的基因。利用生物信息学的方法,首先在人和小鼠基因组数据库中找到了一个与四种α型受体都有一定相似性的片段。RT-PCR验证了该基因确实表达后,利用RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)的方法从小鼠脑中克隆到了该基因cDNA全长序列,并命名为GDNFReceptorAlpha-Like(GRAL)。序列分析表明,GRAL在氨基酸水平与GFRα有20﹪到40﹪同源性。GRAL至少有两种剪切异构体GRAL-A(2080bp)和GRAL-B(1833bp)。利用RT-PCR研究了该基因的组织分布,结果表明,GRAL主要在中枢神经系统表达,且在黑质、海马和脊髓中表达水平相对较高,而在外周器官如心、肝、脾、肺、肾等均检测不到表达。在海马和大脑皮层,GRAL的表达水平随发育时程而变化,在新生时期达到高潮。为了验证其在细胞水平的定位,构建了GRAL-A的真核表达质粒使其在PC12细胞中表达。免疫荧光研究结果显示,该基因表达产物定位在细胞膜上和细胞质中。GRAL-A的过表达能促进PC12细胞突起生长,并抑制血清撤除在PC12细胞和原代培养海马神经元中造成的凋亡。在PC12细胞,发现这种保护作用跟抑制JNK的磷酸化相关。研究提示,GRAL可能是一种新的参与神经发育过程的促存活分子。