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肝纤维化是肝脏对慢性损伤的一种修复反应,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)活化是肝纤维化形成的中心环节。Saile等~[1]认为HSC活化后很难将其由活化逆转为静息状态,主要通过诱导HSC凋亡可使其数量减少,从而逆转肝纤维化。肝星状细胞已成为肝脏纤维化机制及抗肝脏纤维化研究的热点。斑蝥是斑芫青属(Mylabris)昆虫的俗称,斑蝥素(cantharidin CA)是一种半帖烯毒素,是斑蝥抗肿瘤的有效成份;去甲斑蝥素(Norcantharidin NCTD)是斑蝥素的衍生物,由马来酸与呋喃按Diels-Alder人工合成的~[2]。大量体外实验研究表明NCTD可诱导HL60、K562、BEL-7402等肿瘤细胞凋亡~[3],NCTD还具有抗器官组织纤维化作用,文献报道其能够延缓肾间质纤维化~[4-6]。但NCTD在肝脏纤维化的研究,国内外尚未报道。本实验通过观察NCTD对大鼠的肝星状细胞形态、增殖及凋亡的变化,探讨NCTD对肝星状细胞增殖、凋亡的影响及其可能的机制,为今后NCTD在肝脏纤维化方面的治疗提供临床依据。目的:本实验主要通过不同浓度的NCTD干预体外培养的大鼠肝星状细胞,研究其对活化的肝星状细胞增殖、凋亡及周期的影响;以及对肝星状细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)、Caspase3活性的影响。方法:应用MTT法检测NCTD对活化的肝星状细胞增殖的影响;Hoechst33342染色普通电子显微镜及荧光显微镜下观察细胞凋亡形态学变化;流式检测细胞凋亡率及周期;JC-1染色流式及激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜电位;酶标仪检测Caspase3酶活性。结果:1 NCTD对HSCs增殖的影响: MTT法检测细胞增殖显示,不同浓度(0.625μg/ ml、1.25μg/ ml、2.5μg/ ml、5.0μg/ ml、10.0μg/ ml)的去甲斑蝥素分别作用12h、24h、36h与对照组相比A490值明显降低,12h(0.876±0.02、0.855±0.01、0.819±0.02、0.745±0.02、0.638±0.02vs 0.949±0.03,P<0.05),24h(1.068±0.02、1.007±0.02、0.949±0.03、0.881±0.02、0.633±0.02vs1.148±0.01, P <0.05),36h(1.238±0.02、1.023±0.01、0.958±0.02、0.697±0.02、0.567±0.01vs 1.337±0.02,P<0.05),总体均数差异有统计学意义,不同时间对活化的肝星状细胞增殖有抑制作用,且存在一定的剂量与时间依赖性。抑制率同样具有时间与剂量依赖性,12h(6.99%±3.77%、9.85%±3.41%、13.66%±3.02%、21.53%±2.67%、32.73%±3.72%);24h( 6.96%±2.01%、12.64%±2.12%、17.36%±2.92%、23.25%±1.41%、44.85%±1.71%);36h(7.37%±1.64%、23.43%±2.29%、28.44%±2.88%、48.04%±2.85%、57.74%±1.66%),12h后开始抑制HSCs增殖,36h抑制作用明显增强。2去甲斑蝥素对HSCs凋亡的影响:①普通电子显微镜及Hoechest 33342染色荧光显微镜下检测细胞凋亡形态显示:NCTD干预HSCs后,细胞核浓缩、凋亡小体出现,说明NCTD可诱导活化的肝星状细胞凋亡,5.0μg/ mlNCTD作用12h、24h、36h细胞凋亡率(5.31 %±0.29%、18.08%±0.15%、25.45%±0.51%)升高,与空白对照组(2.72%±0.25%)相比有统计学差异(P<0.05)。②流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率结果示:NCTD(1.25μg/ ml、2.5μg/ ml、5.0μg/ ml)干预HSCs36h后对细胞周期的影响显示:与对照组相比,G2/M期细胞数所占比例逐渐增多(19.00%±0.56%、23.03%±0.35%、33.33%±0.72% vs 15.97%±0.45%,P<0.05),S期细胞呈现下降的趋势(30.76%±0.93%、28.80%±1.15%、27.73%±1.20% vs 42.17%±2.00 %,P<0.05);而细胞凋亡率(8.03%±0.50%、16.10%±1.05%、25.63%±1.12%)随药物浓度升高逐渐增高,与对照组(5.23%±0.83%)相比,有显著的统计学差异(P<0.05);当加入Ac-EDVE-CHO后,细胞凋亡率(19.60%±0.70%)较5.0μg/ ml组(25.63%±1.12%)有所下降(P<0.05)。③JC-1试剂盒流式细胞仪法检测细胞的早期凋亡线粒体膜电位改变结果示:5.0μg/ml去甲斑蝥素组分别作用于HSCs 6h、12h、24h与阴性对照组相比线粒体膜电位均降低(0.891±0.057、0.591±0.010、0.714±0.016)较阴性对照组(1.872±0.019)相比,均有统计学差异(P<0.05)。5.0μg/ml去甲斑蝥素组分别作用于HSCs 12h在激光共聚焦显微镜下观察结果显示药物干预组0.016±0.004)、阳性对照组(0.795±0.061)较阴性对照组(1.161±0.077)相比有显著性差异(P<0.05)。④Caspase3活性检测显示:5.0μg/ml的去甲斑蝥素作用活化的肝星状细胞6h、12h、24h、36h后,Caspase3活性(0.657±0.033、0.785±0.037、1.771±0.177、4.806±0.15)较对照组(0.325±0.015)相比明显升高,加入Ac-EDVE-CHO后(2.763±0.152)较去甲斑蝥素36h组有所下降,Caspase3活性总体差异显著有统计学意义(P<0.05),说明去甲斑蝥素可影响Caspase3活性。结论:①体外细胞培养研究表明,去甲斑蝥素可抑制活化HSCs的增殖,其抑制作用具有一定时间和剂量依赖性。②去甲斑蝥素可使活化的HSCs凋亡,可影响细胞周期,并使细胞生长阻滞于G2/M期。③去甲斑蝥素通过线粒体膜电位下降,激活Caspase3酶,促进细胞凋亡。